芍紅消積顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

弓曉東，談瑄忠，毛春芹，陸兔林，蘇丹（.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京20046；2.南京市中醫(yī)院，南京 2000）

芍紅消積顆粒由赤芍、紅花、黃芪等11味藥組成，具有活血化瘀、清熱利濕之功效，用于治療濕熱瘀阻型子宮內(nèi)膜異位癥引起的痛經(jīng)，伴見月經(jīng)過多或經(jīng)期延長等。臨床研究發(fā)現(xiàn)，該方能改善全身和局部血液循環(huán)、降低血漿前列腺素含量和抑制異位內(nèi)膜生長，對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥具有良好的療效[1]。筆者對(duì)本品進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定，對(duì)赤芍等4味藥材進(jìn)行薄層色譜（TLC）鑒別；同時(shí)由于赤芍是本方主藥，芍藥苷是赤芍飲片中主要成分之一，因此采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定方中芍藥苷的含量，以便有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，提高臨床療效。

1 儀器與試藥

1100 HPLC儀、VWD檢測(cè)器（美國安捷倫公司）；FA1104萬分之一電子分析天平（上海天平儀器廠）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）；水浴鍋（鞏義市英峪予華儀器廠）；WD-9403C紫外分析儀（北京市六一儀器廠）；KQ-500B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

芍藥苷對(duì)照品和赤芍、三棱、黃芪、黃芩對(duì)照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110736-200427、121093-200405、121521-200602、120974-200407、120955-200305）；芍紅消積顆粒（批號(hào)：090916、090918、090920）和相應(yīng)陰性樣品均由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院自制；水為重蒸水，乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 赤芍的TLC鑒別 取本品1.3 g，加70%甲醇20 mL，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz）30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液；另取赤芍對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液；再取缺赤芍陰性樣品1.3 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。照TLC法[2]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯（8∶4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[3]。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。赤芍的TLC見圖1。

2.1.2 三棱的TLC鑒別 取本品5 g，加乙醚30 mL，加熱回流0.5 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL使溶解，作為供試品溶液；另取三棱對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液；再取缺三棱的陰性樣品5 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。照TLC法[2]試驗(yàn)，分別吸取上述溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯（8∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視[4]。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。三棱的TLC見圖2。

2.1.3 黃芪的TLC鑒別 取本品 12 g，加水 40 mL，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz）30 min，過濾，濾液用水飽和正丁醇振搖提取2次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次20 mL，棄去氨試液，分取正丁醇振搖提取液，水浴蒸干，殘?jiān)诱麴s水3～5 mL使溶解，通過D101大孔樹脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，長12 cm），加水50 mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去乙醇洗脫液，再用70%乙醇50 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇定容至2 mL，作為供試品溶液；取黃芪對(duì)照藥材4 g，同法制成對(duì)照藥材溶液；再取缺黃芪的陰性樣品2 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。照TLC法[2]試驗(yàn)，分別吸取上述溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水（30∶10∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[5]。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。黃芪的TLC見圖3。

圖1 赤芍的TLC1.赤芍對(duì)照藥材；2～4.供試品；5.陰性對(duì)照Fig 1 TLC of Paeoniae Radix Rubra1.Paeoniae Radix Rubra reference substance；2～4.test samples；5.negative control

圖2 三棱的TLC1.三棱對(duì)照藥材；2～4.供試品；5.陰性對(duì)照Fig 2 TLC of Sparganium stoloniferum1.Sparganii Rhizoma reference substance；2～4.test samples；5.negative control

圖3 黃芪的TLC1.黃芪對(duì)照藥材；2～4.供試品；5.陰性對(duì)照Fig 3 TLC of Astragali Radix1.Astragali Radix reference substance；2～4.test samples；5.negative control

圖4 黃芩的TLC1.黃芩對(duì)照藥材；2～4.供試品；5.陰性對(duì)照Fig 4 TLC of Scutellaria baicalensis1.Scutellariae Radix reference substance；2～4.test samples；5.negative control

2.1.4 黃芩的TLC鑒別 取本品5 g，研細(xì)，加甲醇40 mL，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz）20 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，離心（4 800 r·min-1，15 min），傾出上清液，鹽酸調(diào)pH值為1～2，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯提取液，水浴蒸干，殘?jiān)眉状级ㄈ葜? mL，作為供試品溶液；另取黃芩對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液；再取缺黃芩的陰性樣品5 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。照TLC法[2]試驗(yàn)，分別吸取上述溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。黃芩的TLC見圖4。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（30∶70）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長：230 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按芍藥苷色譜峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000，分離度＞1.5。在此條件下，芍藥苷色譜峰與其他組分峰可達(dá)基線分離，供試品與芍藥苷對(duì)照品在相同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)同一色譜峰，而陰性對(duì)照未出現(xiàn)色譜峰[6]。色譜見圖5。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的芍藥苷對(duì)照品5.21 mg，置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相制成每1 mL含0.521 mg的溶液，搖勻，定容，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，回流30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取濃度為0.521 mg·mL-1的芍藥苷對(duì)照品溶液，加甲醇依次稀釋成濃度為0.052 1、0.104 2、0.208 4、0.312 6、0.416 8、0.521 0 mg·mL-1的系列溶液，各取10 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定。以檢測(cè)濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝13 541.05X－25.34（r＝0.999 8，n＝6）。結(jié)果表明，芍藥苷檢測(cè)濃度在0.052 1～0.521 0 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取芍藥苷對(duì)照品溶液適量，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果，RSD＝0.53%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液適量，在室溫下放置0、2、4、6、8、10 h，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果，RSD＝0.85%（n＝6），表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批芍紅消積顆粒樣品適量，共6份，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果，芍藥苷的平均含量為5.334 2 mg·g-1，RSD＝1.25%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量（含量：5.334 2 mg·g-1）的樣品共9份，每份0.3 g，分別置于具塞錐形瓶中，每3份一組，分別加入芍藥苷對(duì)照品溶液0.8、1.0、1.2 mL（重新制備芍藥苷對(duì)照品溶液，濃度為1.538 mg·mL-1），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均回收率為97.49%，RSD＝1.80%（n＝9）。

2.2.9 樣品含量測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)的樣品適量，每批平行取樣3份，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法測(cè)定并計(jì)算芍藥苷的含量，結(jié)果見表1。

圖5 高效液相色譜圖A.芍藥苷對(duì)照品；B.供試品；C.缺赤芍陰性對(duì)照Fig 5 HPLC chromatogramsA.paeoniflorin control；B.test sample；C.negative control without Paeoniae Radix Rubra

表1 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 1Content determination of samples（n＝3）

3 討論

3.1 前期處理

藥材來源及其品質(zhì)的好壞直接影響成品制劑的質(zhì)量，不同產(chǎn)地的藥材含量均有差異，即使一地所產(chǎn)藥材，也會(huì)因?yàn)椴墒諘r(shí)間、貯藏、運(yùn)輸?shù)葪l件的不同而出現(xiàn)很大的差異。在整個(gè)項(xiàng)目研究中，一方面圍繞著藥材來源及含量測(cè)定，保證制劑原料符合藥典規(guī)定；另一方面最大限度的保證指標(biāo)性成分的轉(zhuǎn)移率，最終得出最佳工藝。

3.2 TLC鑒別

芍紅消積顆粒是一個(gè)復(fù)方制劑，成分較為復(fù)雜，影響鑒別的干擾因素較多。通過參考文獻(xiàn)和預(yù)試驗(yàn)，對(duì)方中赤芍等進(jìn)行TLC鑒別，得到理想的TLC條件。在對(duì)紅花、昆布、蒲公英3味藥材進(jìn)行TLC鑒別時(shí)，供試品在與對(duì)照藥材相同位置處可見明顯同一斑點(diǎn)，但陰性對(duì)照有干擾，尤其是紅花的鑒別，采用了3種試驗(yàn)方法都不能很好鑒別，推測(cè)該檢測(cè)成分可能在制劑中其他藥材中也存在，故鑒別較復(fù)雜，這一問題有待進(jìn)一步研究[7]。本試驗(yàn)也探討了制劑中土鱉蟲的TLC鑒別[8]，采用在展開前，展開箱先用展開劑預(yù)平衡和加大點(diǎn)樣量等方法，均沒有特征斑點(diǎn)出現(xiàn)，推測(cè)該檢測(cè)成分可能在制劑工藝中損失嚴(yán)重。

3.3 含量測(cè)定

對(duì)赤芍中的芍藥苷進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，筆者比較了依利特Hypersil ODS2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），分別采用同一色譜條件進(jìn)行分離。結(jié)果表明，Kromasil C18柱各峰間分離度、對(duì)稱性好，分離效果為佳。在檢測(cè)芍藥苷成分時(shí)，考察了不同流動(dòng)相對(duì)峰形的影響，當(dāng)流動(dòng)相用甲醇時(shí)，峰嚴(yán)重拖尾，分離度差；采用甲醇-水（45∶55）時(shí)，峰形對(duì)稱，但保留時(shí)間過短，分離度不好；用甲醇-水（30∶70）為流動(dòng)相，分離峰形對(duì)稱，保留時(shí)間適中，分離效果為最佳。

本試驗(yàn)所建立的赤芍等藥材的TLC鑒別方法，無干擾，具有專屬性；HPLC定量芍藥苷的方法簡單、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，均可用于芍紅消積顆粒的質(zhì)量分析與控制，但在芍藥苷含量限度方面有待進(jìn)一步深入研究。

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