乳病消片定性鑒別及其延胡索乙素的含量測定

宋三孔，宋 霞，楊效宇，焦海勝

(1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000;2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730030)

乳病消片為蘭州大學(xué)第二醫(yī)院醫(yī)院制劑，由柴胡、丹參、元胡、當(dāng)歸、淫羊藿、黃芪、茯苓等多種藥材組成，具有疏肝解郁、軟堅(jiān)散結(jié)的功效，在醫(yī)院已使用30余年，主要用于治療乳腺炎、乳腺增生等。本試驗(yàn)中采用薄層色譜(TLC)法對處方中黃芪、淫羊藿、茯苓等藥材進(jìn)行定性鑒別，用高效液相色譜(HPLC)法測定處方中元胡藥材延胡索乙素的含量，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，包括G1312A二元泵，G1315B二極管陣列檢測器，G1316A柱溫箱，G2170AA色譜工作站;ME2325S型電子分析天平(德國賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);HPD－25型真空泵(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司);ZF－C型三用紫外分析儀(上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司);CQ50型超聲波清洗器(上海超聲波儀器廠)。延胡索乙素對照品(批號為 110726－200409)、淫羊藿苷對照品(批號為110737－200312)、黃芪甲苷對照品(批號為 110781－200512)，均購自中國藥品生物制品檢定所;硅膠G、H薄層板(青島海洋化工廠);甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純;元胡、淫羊藿、黃芪、茯苓等藥材購自甘肅方正醫(yī)藥有限公司，均符合2010年版《中國藥典(一部)》規(guī)定;乳病消片按蘭州大學(xué)第二醫(yī)院制劑室工藝自制(批號分別為 20101010，20101011，20101012)。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別(薄層色譜法)

2.1.1 淫羊藿[1]

取本品 10片，研細(xì)，稱取1.0 g，加70%乙醇 10 mL，超聲處理30 min后過濾，濾液用水浴蒸干，殘?jiān)? mL乙醇溶解混勻，作為供試品溶液。稱取淫羊藿苷對照品用甲醇溶解配成質(zhì)量濃度為0.1 g/L的對照品溶液。另按處方制備工藝及供試品溶液制備方法制成缺淫羊藿的陰性對照品溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，用乙酸乙酯－丁酮－甲酸－水(10∶1∶1 ∶1)為展開劑展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果供試品溶液與對照品溶液色譜在相應(yīng)位置上顯相同的暗紅色斑點(diǎn);噴三氯化鋁試液，置紫外光燈(365 nm)下檢視，顯相同橙紅色熒光斑點(diǎn)。而陰性對照品溶液色譜無此斑點(diǎn)(圖1A)。

2.1.2 黃芪[2]

取本品 10片，研細(xì)，稱取 2.0 g，加乙醇 30 mL，加熱回流30 min后過濾，濾液用水浴蒸干，殘?jiān)?.3%氫氧化鈉溶液15 mL使之充分溶解，過濾，濾液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至5，每次用乙酸乙酯15 mL振搖萃取3次，取出乙酸乙酯層溶液，用鋪有無水硫酸鈉的濾紙過濾，濾液用水浴蒸干，殘?jiān)? mL乙酸乙酯溶解混勻，作為供試品溶液。稱取黃芪甲苷對照品，用甲醇溶解配成質(zhì)量濃度為1 g/L的對照品溶液。另按處方制備工藝及供試品溶液制備方法制成缺黃芪的陰性對照品溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇(10∶1)為展開劑展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰后，在紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果供試品溶液與對照品溶液色譜在相應(yīng)位置上顯相同黃色熒光主斑點(diǎn)，而陰性對照品溶液色譜無此斑點(diǎn)(圖1B)。

2.1.3 茯苓[2]

取本品10片，研細(xì)，稱取2.0 g，加乙醚50 mL，超聲處理10 min后過濾，濾液用水浴緩慢蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解混勻，作為供試品溶液。稱取茯苓對照藥材1.0 g，按供試品溶液制備方法制成茯苓對照藥材溶液。另按處方制備工藝及供試品溶液制備方法制成缺茯苓的陰性對照品溶液。吸取上述3種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，用甲苯－乙酸乙酯－甲酸(20∶5∶0.5)作為展開劑展開，取出，晾干，噴以2%香草醛硫酸－乙醇(4∶1)混合溶液，在105℃ 加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果供試品溶液與對照藥材溶液色譜在相應(yīng)位置上色譜顯相同顏色主斑點(diǎn)，而陰性對照品溶液色譜無此斑點(diǎn)(圖1C)。

圖1 薄層色譜圖

2.2 延胡索乙素含量測定(高效液相色譜法)

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Luna C18柱(25 mm ×4.60 mm，5 μm);流動相:甲醇 －0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào) pH 至 6.5，70 ∶30);流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:280 nm;進(jìn)樣量:20 μL。在此色譜條件下，理論板數(shù)按延胡索乙素峰計大于3 000。

2.2.2 溶液制備

精密稱取對照品1.44 mg，加甲醇制成每1 mL含延胡索乙素0.144 mg的對照品溶液。取本品20片，研細(xì)，精密稱取3.0 g，置燒瓶中，再精密加濃氨試液－甲醇(1∶20)混合溶液50 mL，稱重，冷浸和加熱回流依次各1 h，放冷，再次稱重，用濃氨試液－甲醇(1∶20)混合溶液補(bǔ)足減失量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液25 mL，用水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，稀釋至刻度，混勻，用0.22 μm有機(jī)膜過濾，并取續(xù)濾液，作為供試品溶液。按處方制備工藝制成缺延胡索的陰性對照品，按供試品溶液制備方法制備延胡索陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn):將2.2.2項(xiàng)下的對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液分別進(jìn)樣20 μL，色譜圖見圖2。可知，延胡索乙素在280 nm波長處無雜質(zhì)干擾。

圖2 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下對照品溶液0.25，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00 mL，置 5 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成 7.2，14.4，28.8，43.2，57.6，72.0，86.4 μg/mL系列質(zhì)量濃度，分別進(jìn)樣 20 μL，以延胡索乙素進(jìn)樣量為橫坐標(biāo) X、峰面積為縱坐標(biāo) Y進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=13.306 X －42.152，r=0.999 9(n=7)。結(jié)果表明，延胡索乙素進(jìn)樣量在0.144～1.728 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好線性關(guān)系。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液20 μL，按擬訂的色譜條件，分別于 0，2，4，6，8，12，24 h 時進(jìn)樣 1 次，測定延胡索乙素的峰面積。結(jié)果的 RSD為1.42%(n=7)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

精密度試驗(yàn):精密吸取同一對照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定延胡索乙素的峰面積。結(jié)果的 RSD為0.97%(n=6)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):精密稱取同一批樣品，依法制備供試品溶液6份，精密吸取20 μL進(jìn)樣。結(jié)果延胡索乙素平均含量為0.032 9 mg/g，RSD 為 1.03%(n=6)。

加樣回收試驗(yàn):稱取已知含量的樣品(含量為0.035 4 mg/g)約 2.0 g共 6 份，各加延胡索乙素對照品溶液(0.144 g/L)0.5，0.5，2.5，2.5，3.5，3.5 mL，按供試品溶液制備方法處理后，混勻，進(jìn)樣20 μL測定。結(jié)果見表1。

表1 延胡索乙素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.4 樣品含量測定

精密稱取3批樣品，依法制備供試品溶液，分別吸取20 μL進(jìn)樣測定，計算延胡索乙素含量。結(jié)果批號為20101010，20101011，20101012的樣品中延胡索乙素含量分別為 0.032 2，0.035 4，0.036 0 mg/g(n=3)。

3 討論

曾用乙腈 －水(55∶45)、甲醇 －水(55∶45)、甲醇 －水(70∶30)作為流動相，但分離度不好，對稱性差，有明顯的前沿峰，且理論板數(shù)不高;采用甲醇－0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào)pH至6.5，70∶30)為流動相，上述問題均得以解決。故本試驗(yàn)采用甲醇－0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào)pH至6.5，70∶30)為流動相。

乳病消片由多種藥材組成，成分復(fù)雜，增加了其全面質(zhì)量控制的難度。關(guān)于其質(zhì)量控制方法，已有相關(guān)文獻(xiàn)報道，多為單藥材的高效液相色譜法含量測定，較零散單一。為了進(jìn)一步完善該處方片劑質(zhì)量控制，本試驗(yàn)建立了方中4種藥材的定性或定量分析方法，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好。淫羊藿、茯苓藥材薄層色譜法鑒別方法可靠，斑點(diǎn)顯色明顯。黃芪薄層色譜鑒別用氨蒸氣熏蒸后斑點(diǎn)顯色不穩(wěn)定，影響重現(xiàn)性，故采用噴以10%硫酸乙醇溶液、105℃加熱后顯色，主斑點(diǎn)明顯而持久。

[1]劉玉成，孫長文，楊紅玉，等.仙靈骨葆片的薄層色譜鑒別[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2006，34(2):25－26.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:224，283 －284.