高效液相色譜法測定耳聾丸中梔子苷和黃芩苷含量

李延雪，邵禮梅，王云龍，蘇玉娟

(黑龍江省雞西市藥品檢驗(yàn)所，黑龍江 雞西 158100)

耳聾丸是由黃芩、梔子、龍膽、地黃、澤瀉、木通、當(dāng)歸等十味中藥經(jīng)適宜加工方法制成的中成藥，收載于2010年版《中國藥典(一部)》[1]，具有清肝瀉火、利濕通竅的功效，臨床用于肝膽濕熱所致的頭暈頭痛、耳聾耳鳴、耳內(nèi)流膿。文獻(xiàn)報(bào)道[2－7]的大多都是測定耳聾丸中黃芩苷的含量。筆者建立了可同時(shí)測定黃芩苷和梔子苷含量的方法。

1 儀器與試藥

島津LC－2010A型高效液相色譜儀，AG285型電子分析天平，KQ－400KDE型超聲波清洗器，島津UV－2550型紫外分光光度計(jì)。梔子苷對照品(批號為110749－200613)、黃芩苷對照品(批號為110715－201016，含量為94.0%)，均由中國藥品生物制品檢定所提供;耳聾丸(批號為101102，100807，101205);水為純化水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Extend － C18柱(250 mm ×4.6 min，5 μm);流動(dòng)相:A為0.5%冰醋酸溶液，B為甲醇，梯度洗脫，時(shí)間程序見表 1;流速:0.8 mL/min;柱溫:室溫;進(jìn)樣量:10 μL;檢測波長:240 nm。理論板數(shù)按梔子苷峰計(jì)算不低于10 000。梔子苷和黃芩苷與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度均大于 1.5。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)間程序

2.2 溶液制備

精密稱取梔子苷和黃芩苷對照品適量，加50%甲醇制成每1 mL中含梔子苷對照品0.027 2 mg和黃芩苷對照品0.156 8 mg的混合溶液，即得對照品溶液。取耳聾丸，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率400 W，頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方量并以相同工藝制備不含梔子和黃芩的陰性對照樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn):取2.2項(xiàng)下3種溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果陰性對照品溶液色譜圖中，在梔子苷和黃芩苷色譜峰相應(yīng)位置上無干擾峰出現(xiàn)，表明陰性樣品的其他組分對梔子苷和黃芩苷的測定無干擾(圖1)。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密吸取含梔子苷和黃芩苷對照品的混合溶液 2，5，10，15，20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸分析，梔子苷回歸方程 Y=2.085×106X －6.064 1×102，r=0.999 7(n=5);黃芩苷回歸方程 Y=5.757 6×105X－1.376 7×103，r=1.000 0(n=5)。結(jié)果表明，梔子苷進(jìn)樣量在0.054 4～0.544 0 μg范圍內(nèi)，黃芩苷進(jìn)樣量在0.313 6～3.136 0 μg范圍內(nèi)均與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):精密吸取同一對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次。以峰面積計(jì)算，梔子苷的 RSD=1.50%(n=5)，黃芩苷的RSD=0.32%(n=5)，表明儀器精密度良好。

重現(xiàn)性試驗(yàn):取同一批樣品(批號為101102)，依法制備6份供試品溶液并測定含量。結(jié)果梔子苷的峰面積 RSD=0.98%(n=6)，黃芩苷的峰面積 RSD=0.34(n=6)，表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一份供試品溶液(批號為101102)，分別于配制后 0，2，4，6，8，12，24 h 依法測定。結(jié)果梔子苷峰面積的RSD=1.12%(n=7)，黃芩苷峰面積的 RSD=0.76%(n=7)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):稱取已知含量的同批樣品(批號為101102，梔子苷含量為2.35 mg/g，黃芩苷含量為15.94 mg/g)6份，每份約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，以兩份為一組，共3組，每組分別精密加入梔子苷 0.412 5，0.585 0，0.732 5 μg，黃芩苷2.922 5，3.990 0，5.297 5 μg，按供試品溶液的制備方法制備以及上述色譜條件測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定峰面積，用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。結(jié)果見表3。

3 討論

本試驗(yàn)曾考察了不同濃度甲醇、稀乙醇超聲提取20，30，40，60 min以及回流提取等方法，通過對梔子苷及黃芩苷的含量測定結(jié)果可知，用50%甲醇超聲提取30 min效果最好。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表3 樣品含量測定結(jié)果含量(mg/g)

以50%甲醇溶液為溶劑對梔子苷和黃芩苷進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果梔子苷在240 nm波長處有最大吸收，黃芩苷在波長278 nm處有最大吸收，兩種成分在240 nm處均有吸收，故選240 nm為測定波長處。

為了達(dá)到良好的分離效果，我們考察了用不同濃度乙腈－水，乙腈 －0.1% 磷酸溶液，甲醇 －水 －磷酸(50∶50∶0.2)，甲醇 －水(75∶25)，甲醇－0.5%冰醋酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行分離，經(jīng)過條件優(yōu)化選擇，采用甲醇－0.5%冰醋酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，可以得到較好的分離效果。

梔子和黃芩作為耳聾丸中的主要組成成分，測定二者中的梔子苷和黃芩苷具有一定的代表意義。該方法簡便、快速、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，回收率好，可作為耳聾丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，以便有效控制該制劑的質(zhì)量。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:673－674.

[2]李 虹.耳聾丸定性及定量研究[J].藥物分析雜志，2009，29(12):2 189－2 192.

[3]劉艷杰，任艷東，于希富，等.高效液相色譜法測定耳聾丸中黃芩苷含量的研究[J].遼寧醫(yī)藥，2007，22(3):286 －287.

[4]李艷榮，蔣日華，郝福，等.RP－HPLC同時(shí)測定功勞去火片中梔子苷、黃芩苷及鹽酸小檗堿的含量[J].中成藥，2006，28(8):1 126－1 129.

[6]李偉佳，王 強(qiáng).HPLC測定4種中藥制劑中梔子苷和黃芩苷的含量[J]. 中成藥，2007，29(8):1 170 －1 172.

[7]謝 東，路 玫，洗銀麗.RP－HPLC法同時(shí)測定藍(lán)琴口服液中梔子苷、黃芩苷及鹽酸小檗堿的含量[J].中國藥師，2008，17(10):1 188－1 190.