體外沖擊波誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化

崔 博 鄭學(xué)清 舒 暢 于鐵成 徐 鵬 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院碎石中心，吉林 長春 300)

長期以來，體外沖擊波(ESW)一直被用于治療泌尿系統(tǒng)結(jié)石，在骨科主要用來治療骨折不愈合、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)慢性勞損性疾病，取得了良好效果，具有創(chuàng)傷小、風(fēng)險(xiǎn)低、費(fèi)用少、周期短等優(yōu)點(diǎn)〔1，2〕，但其機(jī)制尚不完全清楚。Wang 等〔3〕發(fā)現(xiàn)低能沖擊波可促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)細(xì)胞膜的電勢發(fā)生超極化，激活細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)狀激活系統(tǒng)，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)－β1的產(chǎn)生、最終誘導(dǎo)骨小結(jié)形成，提示ESW誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化可能是其治療骨折不愈合等疾病的作用機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)觀察ESW對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)增殖活性的影響，為ESW和hMSCs的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源和主要試劑 骨髓來源于正常成人獻(xiàn)髓者，體外液電沖擊波碎石機(jī)MODEL KDE－2001，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(Gibco公司)，RNeasy mini column 試劑盒(QIAGEN 公司)，RT－PCR 試劑盒、Trizol試劑、DNA Marker(Takara公司)，X－光衍射儀(日本電機(jī)株式會社)。

1.2 hMSCs培養(yǎng) 以健康自愿者為對象，局麻下用含肝素的注射器從髂后上棘抽取5～10 ml骨髓。將骨髓標(biāo)本移入離心管中，加入等體積的無血清的 L－DMEM，1000 r/min，5 min，洗滌多余的脂肪細(xì)胞。將Percoll液和 PBS配制成密度為1.073 g/cm3的細(xì)胞分離液;15 ml離心管內(nèi)加入與血清等體積的分離液后，將收集的骨髓緩慢加在分離液上部，2500 r/min離心30 min，用吸管吸取單個(gè)核細(xì)胞層，分散在含10%胎牛血清的L－DMEM培養(yǎng)液中，接種于塑料6孔培養(yǎng)板，在37℃含5%CO2的飽和濕度空氣中培養(yǎng);接種72 h換液，以后每3～4 d換液，7～10 d首次傳代;當(dāng)細(xì)胞長滿培養(yǎng)孔80%左右時(shí)，用0.25%胰蛋白酶將細(xì)胞消化，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，每3～4 d換液1次，7～10 d傳代。培養(yǎng)至第4代。受試對象的分組及干預(yù):原代 hMSCs長滿至80%時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶－0.01%EDTA消化制成細(xì)胞懸液，即P1代;調(diào)整細(xì)胞密度，然后各取5 ml細(xì)胞懸液，等量接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，分別標(biāo)記為對照組(C)和干預(yù)組(E)。干預(yù)組hMSCs使用ESWO－AJ治療儀施加最佳能流密度0.16 mJ/mm2，即5 kV、100頻次的體外沖擊波干預(yù)，置入體外液電沖擊波碎石機(jī)中，調(diào)整焦點(diǎn)，通過C型臂X光透視裝置，使細(xì)胞懸液中點(diǎn)剛好位于焦點(diǎn)處并固定。對照組樣本不施加干預(yù)。兩組受試對象均置于37℃、5%CO2及飽和濕度條件的孵育箱培養(yǎng)。

1.3 堿性磷酸酶(ALP)活性測定 取沖擊波干預(yù)組和對照組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至110 ×105～115 ×105/ml，加入Triton－X100，4℃過夜，將細(xì)胞裂解液按每孔50 μl加入96孔培養(yǎng)板，干預(yù)組和對照組各10孔，每組設(shè)0.1 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)陽性對照和雙蒸水空白對照各1孔(50 μl/孔)。按試劑盒操作說明依次加入緩沖液、基質(zhì)液各0.5 ml，充分混勻，37℃水浴15 min，再加顯色劑各0.5 ml，用酶標(biāo)儀在520 nm波長處檢測其光吸收值(A)，計(jì)算ALP含量。以同樣的方法測定第2～9代干預(yù)組和對照組細(xì)胞內(nèi)ALP含量。

1.4 X－光衍射分析 分析干預(yù)組和對照組細(xì)胞礦物質(zhì)沉積情況，hMSCs在前述的條件下培養(yǎng)16 d，用PBS洗2遍，從培養(yǎng)瓶表面刮下細(xì)胞及細(xì)胞基質(zhì)，離心1500 r/min 5 min，10%中性甲醛固定，干燥。X－光衍射儀(D－Max/3c)檢測干細(xì)胞和基質(zhì)粉末，測定的圖像用粉末衍射卡片(Powder Diffraction File)JCPD9－432對照鑒定。

2 結(jié)果

2.1 hMSCs培養(yǎng)后的形態(tài)特點(diǎn) 原代細(xì)胞培養(yǎng)10 d后進(jìn)行傳代，對照組與干預(yù)組共傳代16代，每4天傳代1次。細(xì)胞接種于培養(yǎng)板后，第2天可見細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)多樣，分布不均，部分呈巢式生長。同時(shí)可見懸浮的造血細(xì)胞。隨換液次數(shù)增多，懸浮細(xì)胞逐漸減少，直至消失。18 d左右出現(xiàn)貼壁層，貼壁細(xì)胞呈長梭形，突起不明顯，呈魚群狀密集排列。

2.2 沖擊波作用后hMSCs的變化 沖擊波作用后，干預(yù)組第1代即可見細(xì)胞集落形成，每孔8～15個(gè)不等，排列密集;對照組集落形成較少，每孔2～3個(gè)。持續(xù)培養(yǎng)20 d后，干預(yù)組可見鈣結(jié)節(jié)形成，并逐漸增多，而對照組未見鈣結(jié)節(jié)形成。見圖1。

2.3 細(xì)胞內(nèi)ALP形成情況 以出現(xiàn)棕黑色沉淀為陽性。染色后可見，干預(yù)組細(xì)胞均為陽性，對照組細(xì)胞為弱陽性。見圖2。

圖1 MSCs成骨誘導(dǎo)分化后的形態(tài)變化(×100)

2.4 MSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞外基質(zhì)的礦化 培養(yǎng)的MSCs在體外沖擊波的作用下，有大量的礦物沉積形成。X－光衍射測定，在細(xì)胞基質(zhì)中形成的礦物質(zhì)在30°～35°之間形成的波峰與羥基磷灰石的參考標(biāo)準(zhǔn)(JCPDS9－432)一致，證明細(xì)胞基質(zhì)中的礦物質(zhì)沉積為羥基磷灰石。

圖2 MSC向成骨細(xì)胞分化期間ALP染色變化

3 討論

種子細(xì)胞選擇及其規(guī)?；瘮U(kuò)增一直是組織工程面臨的重要課題。BMSCs是目前備受關(guān)注的一類具有多向分化潛能的組織干細(xì)胞，在體內(nèi)外適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)環(huán)境下可以分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經(jīng)、肌腱、韌帶等多種組織細(xì)胞。該細(xì)胞群來源充足，取材方便，增殖能力強(qiáng)，可在體外大規(guī)模擴(kuò)增而不丟失多向分化潛能，并且異體移植免疫排斥反應(yīng)小。對BMSCs研究的不斷深入為解決組織工程細(xì)胞來源難題帶來了前所未有的希望〔4〕。近年來，國內(nèi)外科研人員針對有關(guān)BMSCs的分離、純化、體外擴(kuò)增和分化潛能等，進(jìn)行了廣泛而深入的研究〔5〕。

目前用于體外誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)劑多數(shù)是由地塞米松聯(lián)合β－甘油磷酸鈉及維生素C組成的化學(xué)誘導(dǎo)劑〔6〕，而應(yīng)用物理方法誘導(dǎo)MSCs成骨的研究少見。沖擊波作為一種機(jī)械物理刺激，利用液電能量轉(zhuǎn)換及傳遞原理，造成不同密度組織之間產(chǎn)生能量梯度差及扭拉力，達(dá)到治療目的。它用于治療泌尿系統(tǒng)結(jié)石已成為十分成熟的技術(shù)。而將其作用于骨組織，并治療骨科系統(tǒng)疾病，是近年來的新進(jìn)展〔7，8〕。從實(shí)用性方面看，ESWT作為新的非入侵性骨科治療方法，相對于傳統(tǒng)外科治療有許多優(yōu)勢，與傳統(tǒng)治療方法比較效果更佳，已受到人們廣泛的接受和認(rèn)同。研究表明ESWT治療骨不連、骨折延遲愈合及成人股骨頭缺血性壞死等具有非入侵性、組織損傷小、療效滿意、不會導(dǎo)致基因突變及染色體畸變等優(yōu)點(diǎn)，是一種安全、簡便、有效的治療手段。國內(nèi)外骨科學(xué)者對沖擊波治療骨折不愈合的作用機(jī)制進(jìn)行了大量研究。

ESW干預(yù)MSCs成骨作用存在劑量效應(yīng)依賴關(guān)系。Martini〔9〕研究不同劑量沖擊波對羊初級骨母細(xì)胞的作用效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在沖擊波作用近期內(nèi)，能量小于0.31 mJ/mm2時(shí)對骨細(xì)胞的生長有明顯的促進(jìn)作用，大于此值時(shí)可引起骨細(xì)胞的損傷，認(rèn)為ESW存在劑量效應(yīng)關(guān)系，影響ESW效果的主要因素是能量密度，而與沖擊波作用次數(shù)無關(guān)。Kusnierczak〔10〕研究顯示，沖擊波作用后骨細(xì)胞的生存率依脈沖數(shù)和強(qiáng)度而降低(即劑量依賴生存);當(dāng)沖擊次數(shù)達(dá)到 2000，且能量密度達(dá)到0.51 mJ/mm2時(shí)，細(xì)胞生存率明顯降低;但在沖擊波作用后的第3～8天，中或高能量率2000次脈沖沖擊波作用后的培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生明顯增殖，以至于細(xì)胞的數(shù)量明顯多于低劑量組。這說明，對于骨細(xì)胞來說，中、高劑量的刺激在遠(yuǎn)期效應(yīng)上可促進(jìn)細(xì)胞增殖。另外，Takahashi〔11〕發(fā)現(xiàn)沖擊波作用可促使成骨細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的相關(guān)基因，而這種蛋白是促進(jìn)成骨的重要物質(zhì)。

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