胰島素對(duì)癡呆鼠的保護(hù)作用及機(jī)制

姜禮紅 裴立春 滕宗艷 孟 佳 宋芳芳 張一娜

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年病科，黑龍江 哈爾濱 150086)

阿爾茨海默病(AD)是德國醫(yī)生于1896年發(fā)現(xiàn)的一種腦細(xì)胞逐漸減少的疾病，是導(dǎo)致癡呆的主要原因〔1〕。癡呆是一種與認(rèn)知功能下降相關(guān)的癥候群，隨著人口老齡化進(jìn)程的加快，AD發(fā)病率明顯呈上升趨勢(shì)，給家庭和社會(huì)帶來的負(fù)擔(dān)非常嚴(yán)重，引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注〔2〕。AD發(fā)病機(jī)制中已經(jīng)被廣為接受的一種觀點(diǎn)是:腦中淀粉樣斑塊積聚是引發(fā)AD系列病理改變的觸酶〔3〕。越來越多的實(shí)驗(yàn)已證明Aβ淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒性可能是導(dǎo)致AD重要原因之一，那么尋找使Aβ減少的特殊藥物，則可稱之為一種“治本”的方法。胰島素作為一種激素，其發(fā)揮的血糖調(diào)節(jié)作用已為人們所知。已有研究證實(shí)，在大腦主要的認(rèn)知功能區(qū)存在大量的胰島素受體，可以認(rèn)為胰島素是通過刺激特定的中樞位點(diǎn)來調(diào)整記憶功能，腦室內(nèi)胰島素給藥能改善大鼠記憶的形成〔4〕。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠AD模型，采用皮下注射胰島素作為干預(yù)，對(duì)大鼠認(rèn)知行為、病理以及海馬區(qū)Aβ1～40表達(dá)進(jìn)行了觀察，為進(jìn)一步探討胰島素對(duì)AD的作用，合理應(yīng)用胰島素治療AD提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 Aβ1～40(美國 Sigma公司提供)，大鼠腦立體定位儀(STW－1三維推進(jìn)器，成都儀器廠)，臺(tái)式牙科鉆(307－6，上海齒科醫(yī)械廠)，電子?jì)雰撼?ACS－20－YE，無錫市衡器廠)，微量進(jìn)樣器(YY0088－92，寧波市鎮(zhèn)海三愛儀器廠)，數(shù)顯電熱恒溫水浴箱(HH.W21.600S，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，攝影顯微鏡(OLYMPUS U－SPT型)，胰島素(批號(hào):XV60220，諾和諾德制藥有限公司)，抗Aβ1～40多克隆抗體(美國Sigma公司提供)，免疫組化檢測試劑盒(武漢博士德公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 健康雄性Wistar大鼠(黑龍江省哈爾濱獸醫(yī)研究所提供)，體重(300±20)g，分籠飼養(yǎng)，每籠8只，自由飲食，室內(nèi)常溫下配方料喂養(yǎng)，光照、黑暗各12 h。將大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只:(1)正常對(duì)照組:不進(jìn)行任何處置;(2)模型組:立體定向雙側(cè)海馬CA1區(qū)注射Aβ1～40;(3)鹽水治療組:造模1 d后每日8點(diǎn)給予0.9%生理鹽水(1 ml/kg)腹部皮下注射，用藥21 d;(4)胰島素組:造模1 d后每日8點(diǎn)給予正規(guī)速效胰島素(0.1 U/kg)腹部皮下注射，用藥21 d，根據(jù)文獻(xiàn)〔5〕及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果選擇此給藥劑量，該劑量不會(huì)引起大鼠血糖下降，不影響相應(yīng)檢測時(shí)間點(diǎn)大鼠的活動(dòng)能力。術(shù)后14 d，4組分別作行為學(xué)檢測，術(shù)后21 d取腦做病理學(xué)觀察和免疫組化。

1.2 方法

1.2.1 Aβ1～40的預(yù)處理 用無菌生理鹽水將Aβ1～40(美國Sigma公司提供)稀釋成2 μg/μl，置入電熱恒溫箱37℃孵育1 w，使其變?yōu)槟蹜B(tài)的Aβ1～40。

1.2.2 AD動(dòng)物模型的復(fù)制〔6〕手術(shù)大鼠麻醉后，參照大鼠腦立體定位圖譜〔7〕，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定進(jìn)針點(diǎn)(AP=3.0 mm，ML=2.0 mm，DV=4.0 mm)，選擇雙側(cè)海馬CA1區(qū)為注射靶區(qū)緩慢注入凝聚態(tài) Aβ1～405 μl，5 min 內(nèi)注射完畢，留針 5 min 以保證溶液充分彌散。所有操作均在無菌條件下進(jìn)行。

1.2.3 行為學(xué)檢測 水迷宮:平臺(tái)置于第Ⅲ象限的中間，在其他3個(gè)象限中任選一入水點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)每天訓(xùn)練2次，每次采用不同的入水點(diǎn)，每次訓(xùn)練2 min的方案。訓(xùn)練5 d，分別記錄每只動(dòng)物的潛伏期、游過的路程(定向航行實(shí)驗(yàn))以及在訓(xùn)練的最后1 d，將平臺(tái)移走，分別用秒表記錄每只大鼠第一次經(jīng)過平臺(tái)的時(shí)間即測試潛伏期，并記錄每只大鼠在2 min內(nèi)經(jīng)過平臺(tái)的次數(shù)以及在平臺(tái)所在象限內(nèi)逗留的時(shí)間(空間探索試驗(yàn))，作為評(píng)價(jià)大鼠學(xué)習(xí)成績的指標(biāo)。

1.2.4 病理學(xué)觀察 行為學(xué)測試后進(jìn)行心血管灌注固定法。各組大鼠經(jīng)10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉后，先以冰生理鹽水100 ml快速灌注，再以4%多聚甲醛(4℃)150 ml灌注固定，冰臺(tái)快速取腦做冠狀切面，投入4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)固定、石蠟包埋，連續(xù)冠狀組織切片，片厚5 μm，取海馬部位的切片裱于經(jīng)多聚賴氨酸處理的清潔玻片上，60℃烤箱內(nèi)烘烤2 h后放入4℃冰箱保存，分別行HE、剛果紅染色。

1.2.5 免疫組織化學(xué)檢查 免疫組化染色采用PV二步法，具體操作過程按試劑盒說明書進(jìn)行。陰性對(duì)照用PBS代替一抗，其余步驟相同。

1.2.6 圖像分析 以海馬神經(jīng)細(xì)胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽性結(jié)果。每組取8張腦片，每張細(xì)胞片在海馬CA1區(qū)針道附近隨機(jī)觀察5個(gè)具有代表性的中倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出各個(gè)視野中陽性細(xì)胞數(shù)，由兩名人員獨(dú)立觀察，最后取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)值以±s表示，逃避潛伏期采用重復(fù)測量方差分析，其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 定向航行試驗(yàn) 大鼠造模14 d后，用Morris水迷宮法檢測4組大鼠的定向航行、空間探索能力。定向航行試驗(yàn)結(jié)果見圖1，4組的逃避潛伏期均不斷縮短。開始各組間無顯著差異，經(jīng)過5 d的訓(xùn)練組間出現(xiàn)差異。正常組經(jīng)過5 d訓(xùn)練潛伏期明顯縮短，說明這一組別有學(xué)習(xí)和記憶能力。胰島素組測試潛伏期與正常組相比無顯著差異(P＞0.05)，表明胰島素治療組有學(xué)習(xí)和記憶能力。與模型組和鹽水組相比差異顯著(P＜0.01)，但胰島素組的潛伏期明顯縮短可能是實(shí)驗(yàn)例數(shù)較少的緣故。模型組與正常組相比有顯著差異(P＜0.01)，表明模型組學(xué)習(xí)記憶能力受損。鹽水組和模型組相比無顯著差異，說明鹽水對(duì)AD模型影響不大。

2.2 空間探索試驗(yàn) 在第5天撤去平臺(tái)，以大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)及大鼠在第Ⅲ象限活動(dòng)時(shí)間作為衡量記憶好壞指標(biāo)，模型組穿越站臺(tái)次數(shù)比正常組少55%，模型組大鼠在第Ⅲ象限活動(dòng)時(shí)間比正常組少40%，胰島素組與正常組比較無顯著差異(P＞0.05)，與模型組和鹽水組相比差異顯著(P＜0.01)。模型組和鹽水組與正常組相比有顯著差異(P＜0.01)。見圖2。

2.3 Aβ1～40海馬注射后局部病理改變 光鏡下正常組大鼠海馬區(qū)未見神經(jīng)元損傷，神經(jīng)元排列規(guī)則、緊密、形態(tài)完整。模型組及鹽水對(duì)照組大鼠海馬區(qū)注射點(diǎn)附近可見顆粒細(xì)胞帶明顯受損，局部神經(jīng)元大量缺失，細(xì)胞排列疏松紊亂，部分細(xì)胞缺失，注射點(diǎn)附近出現(xiàn)彌漫性膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，細(xì)胞增生、聚集，核小深染，成扁圓形，判斷為膠質(zhì)細(xì)胞增生，錐體細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯減少。胰島素注射組顆粒細(xì)胞帶輕度受損，神經(jīng)元排列尚規(guī)則，與模型組之間有明顯差異見圖3。剛果紅染色模型組可見細(xì)胞排列紊亂，胞漿內(nèi)可見深染，提示為淀粉樣蛋白聚集，正常組染色較淺，細(xì)胞排列規(guī)則，且胞漿未見異常改變，胰島素組染色較淺，細(xì)胞形態(tài)完整，接近正常組見圖4。2.4 海馬CA1區(qū)Aβ1～40的表達(dá) 模型組及鹽水對(duì)照組海馬CA1區(qū)可見大量棕褐色陽性細(xì)胞〔(57.53±2.99)和(58.10±4.26)〕，胞質(zhì)及軸突、樹突均清晰著色，正常組大鼠海馬CA1區(qū)偶見Aβ1～40免疫陽性神經(jīng)元(7.15±0.62);同擬AD模型組比較，胰島素組大鼠海馬 CA1區(qū)Aβ1～40免疫陽性神經(jīng)元明顯減少或消失(24.05±0.84，P＜0.01)，同正常組比較其他三組Aβ1～40免疫陽性神經(jīng)元明顯受損(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5。

圖1 大鼠空間定向航行能力

圖2 大鼠空間探索能力

圖3 各組海馬HE染色病理學(xué)圖片(×40)

圖4 各組海馬剛果紅染色病理學(xué)圖片(×40)

圖5 各組大鼠海馬CA1區(qū)Aβ1～40表達(dá)(DAB，×40)

3 討論

AD是一種以慢性進(jìn)行性記憶、認(rèn)知等智能障礙為主要臨床表現(xiàn)、與增齡相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其典型的病理變化是腦內(nèi)出現(xiàn)大量的因β－淀粉樣蛋白積聚所形成的老年斑、因tau蛋白異常磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)元丟失等。海馬作為邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，是近記憶回路的重要結(jié)構(gòu)，是學(xué)習(xí)記憶的重要解剖基礎(chǔ)和神經(jīng)中樞，海馬結(jié)構(gòu)的序化板層構(gòu)筑和神經(jīng)元相對(duì)獨(dú)立分布等特點(diǎn)使其成為最理想的學(xué)習(xí)記憶的研究模型，海馬不同區(qū)域的功能不盡相同，其中CAl區(qū)在學(xué)習(xí)、記憶中擔(dān)負(fù)重要作用〔8〕，許多研究表明，海馬與機(jī)體衰老、AD及癲癇發(fā)作有著非常密切的關(guān)系〔9〕。

自從1978年在大鼠腦組織提取物中發(fā)現(xiàn)有胰島素存在的證據(jù)以來，相繼證實(shí)人類及哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的廣泛區(qū)域中存在胰島素及其受體，胰島素在神經(jīng)系統(tǒng)中有著特殊的生物學(xué)效應(yīng)，在調(diào)節(jié)腦能量代謝，促進(jìn)神經(jīng)生長發(fā)育，調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長活動(dòng)和遞質(zhì)釋放等方面起著重要作用〔10～12〕。對(duì)人和動(dòng)物的研究表明，當(dāng)與認(rèn)知有關(guān)的大腦皮層、海馬等部位得不到充分的胰島素或?qū)σ葝u素失去反應(yīng)時(shí)，可發(fā)生記憶減退的輕型Alzheimer病〔13〕。對(duì)大鼠腦室內(nèi)注射鏈脲佐菌素以破壞IR，可造成嚴(yán)重的學(xué)習(xí)和記憶損傷〔14〕。

本實(shí)驗(yàn)采用海馬微量注射凝聚態(tài)Aβ1～40的方法建立擬AD大鼠模型，對(duì)注射部位、注射量及注射藥物的孵化作了改進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)記憶障礙的設(shè)備是帶攝像裝置及分析軟件的水迷宮，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不受人為因素影響，更客觀、真實(shí)可靠。

本實(shí)驗(yàn)胰島素劑量選用0.1 U/kg皮下注射，參考相關(guān)文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該劑量不會(huì)影響大鼠血漿血糖水平，但胰島素組大鼠出現(xiàn)毛色無光澤，且體重增長不明顯。同時(shí)為避免在行為學(xué)習(xí)時(shí)胰島素組出現(xiàn)高胰島素水平，因?yàn)橐葝u素有鞏固情感記憶的作用，因此給藥在行為學(xué)習(xí)之后進(jìn)行。在過去研究中有的直接計(jì)算每天的平均逃避潛伏期后再進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析，或根據(jù)大鼠的逃避潛伏期在定位航行試驗(yàn)后3 d趨于穩(wěn)定的情況，僅對(duì)后3 d的平均逃避潛伏期進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析。但趨于平穩(wěn)的后3 d的平均逃避潛伏期代表記憶水平，僅在生理狀態(tài)下的大鼠才表現(xiàn)如此。而實(shí)驗(yàn)記憶損傷組大鼠后3 d的逃避潛伏期仍然持續(xù)下降。且在給予某種處理后，在不同的時(shí)間點(diǎn)上從同一受試對(duì)象上重復(fù)測量獲得的數(shù)據(jù)受多種因素影響，同一受試動(dòng)物的不同時(shí)間點(diǎn)所測得的逃避潛伏期存在高度的自相關(guān)性，據(jù)此我們?cè)囼?yàn)中定位航行試驗(yàn)的逃避潛伏期采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。然后分別對(duì)第1天最初潛伏期和第5天測試潛伏期進(jìn)行單因素方差分析。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AD大鼠模型組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，而應(yīng)用胰島素后，大鼠在定向航行試驗(yàn)、空間探索試驗(yàn)中學(xué)習(xí)記憶能力均明顯改善，表明胰島素具有改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶的作用。但胰島素組的潛伏期明顯縮短可能是實(shí)驗(yàn)例數(shù)較少的緣故。雖已有證據(jù)表明腦組織可自身合成胰島素，然而這種合成功能僅局限于少數(shù)腦區(qū)，且合成量甚微。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，I125標(biāo)記的胰島素能通過兔的血腦屏障，中央隆起和微血管中存在血漿胰島素的專一吸收位點(diǎn)。因此本實(shí)驗(yàn)采用皮下注射胰島素的方法既避免了腦室內(nèi)給藥造成大腦機(jī)械性損傷的可能，也說明外周胰島素水平可以影響腦內(nèi)胰島素的含量，對(duì)擬AD大鼠模型有治療作用。在海馬HE、剛果紅染色方面，模型組表現(xiàn)顆粒細(xì)胞帶明顯受損，局部神經(jīng)元大量缺失，細(xì)胞排列疏松紊亂，部分細(xì)胞缺失，注射點(diǎn)附近出現(xiàn)彌漫性膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，胰島素組顆粒細(xì)胞帶輕度受損，神經(jīng)元排列尚規(guī)則。胰島素皮下注射3 w的擬模型大鼠與模型組比較，CA1區(qū)Aβ1～40表達(dá)明顯減少或消失，提示胰島素具有改善擬 AD模型大鼠腦組織病理改變及降低Aβ1～40表達(dá)的作用，證實(shí)了胰島素的治療作用。該實(shí)驗(yàn)治療時(shí)間較長共21 d，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力改善明顯，但仍不能完全改變已形成的病理變化，如停止給藥病理變化可能會(huì)繼續(xù)進(jìn)展，因此還應(yīng)進(jìn)行延長胰島素治療時(shí)間的實(shí)驗(yàn)，以探討長期應(yīng)用胰島素治療AD療效。

對(duì)AD患者的研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦內(nèi)IR增加，但信息傳導(dǎo)途徑障礙，即存在與2型糖尿病相似的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，認(rèn)為胰島素能通過抑制人神經(jīng)細(xì)胞株糖原合成激酶－3的活性，抑制細(xì)胞外淀粉樣蛋白的沉積。據(jù)此推論，胰島素皮下注射擬AD模型大鼠使Aβ1～40表達(dá)減少可能是大鼠學(xué)習(xí)記憶能力改善的原因之一，但這一機(jī)制還需進(jìn)一步探究。本實(shí)驗(yàn)未對(duì)外周及腦內(nèi)Aβ1～40及胰島素水平進(jìn)行檢測，并與臨床資料進(jìn)行比對(duì)，該模型是否符合AD的病理生理進(jìn)展過程還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

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