雙向凝膠電泳和二維色譜技術(shù)檢測(cè)大腸癌蛋白質(zhì)譜的意義

李 峰 師慶紅 張曉靜 何成彥 趙麗純 郭宏華 (吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 30033)

大腸癌(colon cancer)是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，死亡率在世界范圍內(nèi)居各種腫瘤的第三位，在西方居第二位，并且發(fā)病率和死亡率均有逐年上升的趨勢(shì)〔1，2〕。大腸癌的發(fā)生和發(fā)展受到基因和環(huán)境等多種因素的影響，其病理機(jī)制復(fù)雜，從單一的基因突變和分子通道的變化難以全面理解大腸癌的發(fā)生機(jī)制。蛋白質(zhì)組學(xué)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新興學(xué)科，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤研究的諸多方面。本文擬采用雙向凝膠電泳和二維色譜技術(shù)分析Dukes B期大腸癌腫瘤與癌旁組織蛋白質(zhì)的差異性，為大腸癌的早期診斷、生物學(xué)治療尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 收集吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院手術(shù)治療的大腸癌患者18例，年齡49～78歲，其中男13人，女5人。在手術(shù)中獲得的癌組織均是新鮮標(biāo)本。所獲得的癌旁正常組織均距離癌邊緣10 cm之外、切緣正常組織，并且所取的正常組織標(biāo)本均是在癌組織上端。標(biāo)本離體后立即取材，生理鹽水沖洗，放入液氮冷凍，－80℃保存。病人術(shù)前未接受任何治療。取部分組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE常規(guī)染色，病理學(xué)檢查證實(shí)組織類型，均是Dukes B腺癌。

1.2 主要試劑 載體兩性電解質(zhì)(Bio－Lyte 3－10)、IPG預(yù)制膠條(pH3～10，17 cm;pH5～8，17 cm)、礦物油、碘代乙酰胺(IAA)購(gòu)自 Bio－Rad 公司(Hercules，CA，USA)。尿素、硫脲、精胺、蔗糖、甘油、三羥甲基氨基甲烷、3－〔(3－膽酰胺丙基)－二乙胺〕－丙磺酸(CHAPS)、丙烯酰胺、N，N，N′，N′－四甲基乙二胺(TMED)、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉(SDS)、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)G－250、苯甲基磺酰氟(PMSF)購(gòu)于 Sigma 公司(St Louis，MO，USA)。低熔點(diǎn)瓊脂糖、甲叉雙丙烯酰胺、DTT、TPCK修飾的測(cè)序級(jí)胰酶購(gòu)自Promega公司。過(guò)硫酸銨、碳酸氫氨、硝酸銀、甲醛、乙醇、硫代硫酸鈉、冰乙酸為國(guó)產(chǎn)分析純。蛋白質(zhì)定量試劑盒(RC DC Protein Assay Kit)購(gòu)于Bio－Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 雙向凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)鑒定大腸癌腫瘤與癌旁組織的差異蛋白質(zhì)組 利用裂解緩沖液制備腫瘤組織與癌旁組織總蛋白，然后分別取腫瘤組織與癌旁組織總蛋白各1 mg，分別加入水化上樣緩沖液至終體積300 μl。經(jīng)pH 3～10等電聚焦分離和 SDS－PAGE電泳分離后，考馬斯亮藍(lán)染色，利用PDQUEST軟件對(duì)電泳圖像進(jìn)行分析、剪切，建立匹配組并進(jìn)行歸一化處理。最后建立分析組，比較匹配點(diǎn)之間光吸收度的差異，獲得腫瘤組織與癌旁組織總蛋白質(zhì)的差異蛋白表達(dá)譜。

1.3.2 二維色譜技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)鑒定大腸癌腫瘤與癌旁組織的差異蛋白質(zhì)組 首先利用裂解緩沖液制備腫瘤組織總蛋白，然后分別用25 mmol/L NH4HCO3稀釋，使尿素濃度低于2 mmol/L。經(jīng)酶解后，將酶解產(chǎn)物進(jìn)行二維液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析，得到腫瘤組織酶解混合物的多肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 雙向凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)

2.1.1 腫瘤組織與癌旁組織的差異蛋白表達(dá)譜 腫瘤組可分離(614±36)個(gè)蛋白點(diǎn)，癌旁組可分離(682±24)個(gè)蛋白點(diǎn)，匹配率為83.3%。其中腫瘤組織中21個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)量有顯著差異，其中有14個(gè)表達(dá)上調(diào)，有7個(gè)表達(dá)下調(diào)。

2.1.2 21個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定 直接切取21個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，進(jìn)行膠內(nèi)酶切和肽段提取。然后在 MALDI－TOFTOF(DE STR，Applied Bio systems)質(zhì)譜儀上進(jìn)行肽質(zhì)量指紋分析。將得到的數(shù)據(jù)用Mascot檢索引擎在Swiss Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，對(duì)21個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定。

2.2 二維色譜技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)

2.2.1 腫瘤組織總蛋白酶解混合物二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析共鑒定29825個(gè)多肽序列，得到860個(gè)蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)據(jù)。

2.2.2 癌旁組織總蛋白的二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析 共鑒定了40388個(gè)多肽序列，共得到549個(gè)蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)據(jù)。

2.2.3 腫瘤與癌旁組織差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析 應(yīng)用實(shí)驗(yàn)中每個(gè)蛋白的圖譜評(píng)價(jià)其豐度。對(duì)于在不同樣品中豐度發(fā)生變化的蛋白，其譜圖數(shù)變化必須滿足以下原則:①兩個(gè)樣品中譜圖數(shù)的比值≥1;②兩個(gè)樣品中譜圖數(shù)的差值≥72(平均每次實(shí)驗(yàn)差值為24)。為評(píng)價(jià)上述方法用于鑒別蛋白豐度變化的假陽(yáng)性率，每個(gè)樣品進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，然后比較結(jié)果，相應(yīng)假陽(yáng)性率為2.13%。將腫瘤與癌旁組織的蛋白質(zhì)組分析的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，依據(jù)上述評(píng)價(jià)原則及標(biāo)準(zhǔn)得到44個(gè)蛋白質(zhì)具有顯著差異，其中腫瘤組織中21個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，23個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。

2.3 雙向凝膠電泳和二維色譜技術(shù)的對(duì)比 在大腸癌腫瘤組織與癌旁組織差異蛋白中有13個(gè)蛋白得到一致的鑒定結(jié)果，其中在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)的蛋白有7個(gè)，表達(dá)下調(diào)的蛋白有6個(gè)。見(jiàn)表1。

表1 腫瘤組織表達(dá)上調(diào)(A1～A7)和下調(diào)(B1～B6)的蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果

3 討論

雙向凝膠電泳和二維色譜一直是目前蛋白質(zhì)組學(xué)的兩大重要分離技術(shù)，雙向凝膠電泳作為傳統(tǒng)的技術(shù)手段由于其價(jià)格較低、易于操作等特性，一直被大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所采用〔3，4〕。但是一些特殊的蛋白質(zhì)，如:強(qiáng)堿、強(qiáng)酸，過(guò)大、過(guò)小以及膜蛋白質(zhì)，現(xiàn)在還不能用雙向凝膠電泳方法進(jìn)行分離，所以需要發(fā)展其他相關(guān)技術(shù)。而隨著色譜技術(shù)的迅猛發(fā)展，發(fā)展可替代或補(bǔ)充雙向凝膠電泳的新方法成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)最主要的目標(biāo)。由于二維色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有分析范圍廣、分析能力強(qiáng)、定性分析結(jié)果可靠、檢測(cè)限低、分析時(shí)間快、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，所以液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)成為分離、鑒定復(fù)雜混合物最有效的手段〔5，6〕。二維色譜(2D－LC)、二維毛細(xì)管電泳(2D－CE)、液相色譜－毛細(xì)管電泳(LC－CE)等新型分離技術(shù)都有補(bǔ)充和取代雙向凝膠電泳之勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)利用雙向凝膠電泳和二維色譜兩大分離技術(shù)對(duì)Dukes B期大腸癌腫瘤組織與癌旁組織進(jìn)行鑒定分析，兩種方法所得到的結(jié)果有不一致的地方，主要原因?yàn)?①雙向凝膠電泳方法測(cè)定的pH范圍相對(duì)液質(zhì)聯(lián)用要窄，雙向電泳等電聚焦分離的pH是3～7，而二維色譜方法測(cè)定的范圍要比雙向電泳廣;②雙向凝膠電泳在蛋白質(zhì)提取的過(guò)程中必須考慮到去除影響蛋白質(zhì)可溶性和重復(fù)性的物質(zhì)，比如核酸、脂類、多糖等大分子以及鹽類小分子。大分子的存在會(huì)阻塞凝膠孔徑，鹽濃度過(guò)高會(huì)降低等電聚焦的電壓，甚至?xí)p壞IPG膠條，這樣都會(huì)造成2－DE的失敗，而二維色譜方法分析范圍廣、分析能力強(qiáng)、檢測(cè)限低。但兩者共同鑒定出的差異蛋白質(zhì)對(duì)研究大腸癌的發(fā)病、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)機(jī)制提供了依據(jù)和方向。

1 Huerta S，Goulet EJ，Livingston EH.Colon cancer and apoptosis〔J〕.Am J Surg，2006;191(4):517－26.

2 Ahmed FE.Colon cancer:prevalence，screening，gene expression and mutation，and risk factors and assessment〔J〕.J Environ Sci Health，2003;21(2):65－131.

3 Kuroda N，Naras E，Miyazaki E，et al.Vinculin:its possible use as marker of 90 normal collecting ducts and renal neoplasms with collecting duct system phenotype〔J〕.Mo Pathol，2000;13(10):1109－14.

4 MacDonald N，Shivers W，Narum D，et al.Endostatin binds tropomyosin.Apotential modulator of the antitumor activity of endostatin〔J〕.J Biol Chem，2001;276(27):25190－6.

5 Williams RE，Major H，Lock EA，et al.D－Serine－induced nephrotoxicity:a HPLC－TOF/MS－based metabonomics approach〔J〕.Toxicology，2005;207(2):179－90.

6 Wilson ID，Plumb R，Granger J，et al.HPLC－MS－based methods for the study of metabonomics〔J〕.J Chrom，2005;817(1):67－76.