肌肉免疫DC-EBV-LMP2誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的研究

杜海軍 王 湛 尉秀霞 周 玲* 馬 晶 馮 霞 葉樹(shù)清 曾 毅*

（中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防與控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100052）

樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC）是1973年美國(guó)洛克菲勒大學(xué)的Steinman和Cohn教授從小鼠的外周淋巴器官首次發(fā)現(xiàn)的[1]，是體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞（Antigen present cell，APC），也是唯一能激活初始型T細(xì)胞的APC，被稱為天然“免疫佐劑”，在抗感染、抗腫瘤、移植排斥等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。目前以DC為基礎(chǔ)的疫苗在治療腫瘤方面，尤其在某些晚期腫瘤等的臨床治療方面已經(jīng)取得一些的成效[3-7]。鼻咽癌（Nasoparyngeal carcinoma，NPC）是我國(guó)南方一些?。ㄗ灾螀^(qū)）的常見(jiàn)惡性腫瘤之一。目前放射治療是鼻咽癌治療的基本方法，但中晚期鼻咽癌治療后常常復(fù)發(fā)或向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，對(duì)于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的患者在臨床上尚無(wú)有效治療方案。EBV-LMP2是NPC細(xì)胞表達(dá)的病毒抗原之一，是誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的理想靶抗原。以DC為基礎(chǔ)的疫苗其免疫方式報(bào)道多為靜脈回輸、淋巴結(jié)注射和皮內(nèi)（下）注射[8-11]。我們以肌肉免疫方式注射DC-EBV-LMP2，研究LMP2誘導(dǎo)的特異性CTL。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Balb/C鼠購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。優(yōu)級(jí)胎牛血清購(gòu)自Invitrogen公司。rAd-LMP2：深圳清華源興生物醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)。LMP2單抗購(gòu)于SantaCruz公司；熒光標(biāo)記羊抗鼠IgG及HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自北京中衫生物技術(shù)公司；流式檢測(cè)抗體購(gòu)自Biolegend公司；重組小鼠細(xì)胞因子購(gòu)自Peprotech公司；ELispot Kit購(gòu)自BD公司；細(xì)胞培養(yǎng)液由病毒病預(yù)防控制所配液室提供。

1.2 小鼠骨髓細(xì)胞分離與DC的誘導(dǎo)培養(yǎng)

斷頸法處死小鼠，取出小鼠股骨骨髓，制成成單細(xì)胞懸液，以小鼠淋巴細(xì)胞分離液（達(dá)科為）分離骨髓細(xì)胞（2000rpm/min，30min）。洗滌2次（1500rpm/min，10min），獲得小鼠骨髓細(xì)胞。以4×106/孔濃度接種在6孔培養(yǎng)板中，37℃5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h。輕微晃動(dòng)培養(yǎng)液，吸掉上清中的懸浮細(xì)胞，以無(wú)血清1640輕輕沖洗3～4遍，加入含細(xì)胞因子（rmGM-CSF200U，rmIL-410U，rmTNF-α100U）10%胎牛血清的RPMI1640，37℃5%CO2培養(yǎng)，3d后，半量更換含細(xì)胞因子培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至7d。

1.3 DC-EBV-LMP2制備

用移液管吹打細(xì)胞，收集懸浮細(xì)胞團(tuán)，1500rpm/min，離心10min，獲得小鼠的DC。以100Tcid50的rAd-LMP2感染吸附DC1小時(shí)（體積在0.5～1mL內(nèi)），然后在含細(xì)胞因子（rmGM-CSF200U，rmIL-410U，rmTNF-α200U）10%胎牛血清的RPMI1640作用下，培養(yǎng)48h。第9天收集成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞（1500rpm/min，10 min）。

1.4 DC表達(dá)LMP2的檢測(cè)：

取5μL DC-EBV-LMP2懸液滴在載玻片的小孔內(nèi)，晾干后，冷丙酮4℃固定。分別以LMP2單抗（1?100稀釋）、生物素標(biāo)記標(biāo)IgG抗體（1∶100稀釋）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記標(biāo)抗生物素的IgG抗體（1∶100稀釋）與涂片細(xì)胞作用（37℃，40min）。每次PBS沖洗3遍。最后將細(xì)胞片浸泡于聯(lián)苯二胺顯色液中1min，然后在顯微鏡下觀察LMP2在DC中表達(dá)。

1.5 DC-EBV-LMP2免疫Balb/C鼠實(shí)驗(yàn)

將Balb/C鼠30只，分為3組，按（表1）的設(shè)計(jì)進(jìn)行小鼠免疫。在初次免疫后的第5周和第8周，處死小鼠（每次每組5只），取脾臟分離淋巴細(xì)胞進(jìn)行LMP2特異性細(xì)胞免疫檢測(cè)。

表1 小鼠免疫方案設(shè)計(jì)

1.6 小鼠IFN-γElispot的檢測(cè)

按照試BD劑盒使用說(shuō)明，將包被抗體，以2.5×105/孔接種細(xì)胞，LMP2多肽（AAALALLASLIL和ASCFTASVSTVV各2μL/孔）刺激物5μg/mL，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照1×105/孔（加PHA或ConA刺激1μg/孔）、陰性對(duì)照2.5×105/孔、空白對(duì)照（加100μL/孔培養(yǎng)液）。按說(shuō)明書(shū)步驟依次加入檢測(cè)抗體、酶標(biāo)的鏈霉親和素和顯色液。用BiosysBioreader4000PRO自動(dòng)讀板儀讀取斑點(diǎn)，并作統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 CD8+T/CD3+T亞群檢測(cè)

按說(shuō)明書(shū)在淋巴細(xì)胞中加入熒光標(biāo)記CD8和CD3抗體，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（空白）、單色陽(yáng)性對(duì)照及多色檢測(cè)樣本，室溫孵育20min。PBS洗滌2次，200目濾網(wǎng)過(guò)濾后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 DC制備與LMP2在DC中的表達(dá)

在細(xì)胞因子誘導(dǎo)下，小鼠骨髓分離的單核細(xì)胞逐步分化成樹(shù)突狀細(xì)胞。以100 MOI rAd-LMP2感染DC 48h后，免疫酶法可以檢測(cè)到LMP2在DC中表達(dá)（圖1）。

圖1 LMP2在小鼠骨髓來(lái)源DC中表達(dá)檢測(cè)

2.2 DC-EBV-LMP2誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答

經(jīng)過(guò)0、2、4周免疫后，用IFN-γElispot法測(cè)定LMP2特異性CTL，結(jié)果顯示DC-EBV-LMP2免疫組特異性CTL（308±167）數(shù)量明顯高于PBS組（18±6）和DC組（26±12）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：P＜0.01具有顯著差異（圖2）。在免疫后的第8周仍然檢測(cè)到，只是較第5周有所降低（圖3）。

2.3 免疫后細(xì)胞亞群變化

以流式細(xì)胞儀檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中CD8+T/CD3+T細(xì)胞亞群的比值，數(shù)據(jù)顯示在小鼠0，2，4周免疫后的第5周，DC-EBV-LMP2免疫組CD8+T/CD3+T細(xì)胞亞群的比值較PBS和DC組有所升高，但統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析P＞0.05，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在第八周再次檢測(cè)CD8+T/CD3+T細(xì)胞亞群的比值時(shí)是顯示，DC-EBV-LMP2免疫組CD8+T/CD3+T細(xì)胞亞群的比值低于PBS和DC組。

圖2 小鼠0、2、4周免疫后第五周IFN-γElispot檢測(cè)結(jié)果

圖3 小鼠免疫后第八周IFN-γ Elispot檢測(cè)結(jié)果

3 討論

我們以前研究結(jié)果表明：以pcDNAⅢ-LMP2真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠可誘發(fā)LMP2特異性細(xì)胞和體液免疫[12]。rAd-LMP2以灌胃、肌肉注射和滴鼻的方式感染小鼠，均可誘發(fā)小鼠針對(duì)LMP2的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫[13,14]。EBV-LMP2DNA疫苗、腺相關(guān)病毒（adenoassociated virus，AAV）疫苗、非復(fù)制5型腺病毒疫苗（Ad5）聯(lián)合免疫Balb/C小鼠能夠更好地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答[15]。rAd-LMP2肌肉免疫恒河猴可以誘導(dǎo)EBV-LMP2特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答及抗體應(yīng)答，且免疫應(yīng)答水平的高低與病毒劑量的高低相關(guān)[16]。rAd5F35-LMP2重組腺病毒疫苗在恒河猴體內(nèi)誘導(dǎo)EBV-LMP2特異性的免疫應(yīng)答[17]。國(guó)內(nèi)外眾多的文獻(xiàn)報(bào)道，DC的免疫途徑有皮下、皮內(nèi)、淋巴結(jié)注射和靜脈回輸?shù)?，未?jiàn)有肌肉免疫的報(bào)道。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)DC-EBV-LMP2肌肉免疫小鼠后能夠誘導(dǎo)LMP2特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。由于LMP2刺激產(chǎn)生了較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，生成大量的直接具有殺傷效應(yīng)的細(xì)胞即細(xì)胞毒T細(xì)胞，造成了免疫后DC-EBV-LMP2組較PBS和DC組的CD8+T細(xì)胞亞群有所增高，DC免疫組與PBS組比較也有所升高，可能為DC刺激所致。隨著特異性CTL與靶細(xì)胞結(jié)合后釋放穿孔蛋白使靶細(xì)胞破裂，免疫應(yīng)答結(jié)束，大部分細(xì)胞死亡，微量變成記憶T細(xì)胞長(zhǎng)期存在。

由于記憶T細(xì)胞存在，使我們?cè)诘诎酥苋阅軌驒z測(cè)到LMP2特異性的免疫應(yīng)答，雖然隨著時(shí)間的推移，絕大多數(shù)的CTL已經(jīng)死亡，因而免疫應(yīng)答強(qiáng)度有所降低，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC-EBV-LMP2組CD8+T細(xì)胞亞群比值明顯低于其他兩組，恰好是一個(gè)有力的證據(jù)。除此之外，我們注意到免疫后第八周CD8+T細(xì)胞亞群水平整體上有所降低，一方面由于小鼠自身CD8+T細(xì)胞亞群經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后，除記憶細(xì)胞外，其余的大部分凋亡細(xì)胞所致，另一個(gè)原因可能是不同老鼠實(shí)驗(yàn)批次間的差異造成，隨著時(shí)間延長(zhǎng)小鼠“衰老”也可能起一定的作用。在實(shí)驗(yàn)中我們未檢測(cè)CD4+T細(xì)胞在小鼠免疫應(yīng)答過(guò)程中的變化，尤其是CD25+CD4+T細(xì)胞亞群在特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答過(guò)程中，起著維持自身耐受和避免免疫反應(yīng)過(guò)度損傷機(jī)體的重要作用，也許與CD8+T/CD3+T的比值變化相關(guān)。

從我們目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，雖然DC-EBV-LMP2組誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答的水平明顯高于PBS和DC組，但組內(nèi)小鼠間的數(shù)值差異較大，在今后的實(shí)驗(yàn)中需要進(jìn)一步增加每組小鼠的數(shù)量，減小鼠間差異。免疫后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，免疫應(yīng)答的強(qiáng)度衰減，這提示我們?cè)诮窈蟮呐R床免疫治療中，需要再次免疫或與其它疫苗聯(lián)合應(yīng)用來(lái)維持細(xì)胞免疫的強(qiáng)度。我們正在進(jìn)行這一方面的探索。

[1] Steinman RM,Cohn ZA.Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice I Morphology quantitation tissue distribution[J].J Exp Med,1973,11(37):1142-1162.

[2] Steinman RM.The dendritic cell system and its role in immunogenicity[J].Annu Rev Immunol,1991,l9(2):271-296.

[3] Nestle FO,Alijagic S,Gilliet M.tumor lysate-pulsed dendritic cells[J].Nat Med,1998,4(3):328-332.

[4] O`Rourke MG,Johnson MK,Lanaqan CM,et al.Dendritic cell immunotherapy for stage Ⅳ melanoma[J].Melanoma Res,2007,17(5):316-322.

[5] Fong L,Brockstedt D,Benike C,et al.Dendritic cell-based xenoantigen vaccination for prostate cancer immunotherapy[J].J Immunol,2001,67(12): 7150-7156.

[6] Yamaquchi Y,Ohta K,Kawabuchi Y,et al.Feasibility study of adoptive immunotherapy dendritic cell-activated killer(PDAK)cells[J].Anticancer Res,2005,l25(3c):2407-2415.

[7] Avigan D,Vasir B,Gong J,et al.Fusion cell vaccination of patients with metastatic breast[J].Clin Cancer Res,2004,10(14):4699-4708.

[8] Mackensen A,Meidenbauer N,Vogl S,et al.PhaseⅠstudy of adoptive T-cell therapy using antigen-specific[J].J Clin Oncol,2006,24(31):5060-5069.

[9] Lambert LA,Gibson GR,Maloney M,et al.Intranodal immunization with tumor lysate-pulsed [J].Cancer Res,2001,61(2):641-646.

[10] Lin CL,Lo WF,Lee TH,et al.Immunization with Epstein-Barr Virus peptide-pulsed dendritic cells induces carcinoma[J].Cancer Res,2002,62(23):6952-6958.

[11] Zuo JM,Zhou L,Chen ZJ,et al.Induction of cytotoxic T lymphocyte responses nasopharyngeal carcinoma[J].J.Microbiol immunol,2006,l4(1):41-48.

[12] 朱偉嚴(yán),周玲,王琦,等.EB病毒潛伏膜蛋白2DNA疫苗的構(gòu)建及其初步免疫效果觀察[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2002,22(2):185-190.

[13] 姚佳偉,周玲,王琦,等.EB病毒潛伏膜蛋白2重組腺腺病毒的構(gòu)建及其免疫效果的研究[J].中國(guó)腫瘤,2003,12(1):45-47.

[14] 左建民,周玲,王曾毅,等.含EBV-LMP2基因重組腺病毒疫苗的構(gòu)建及其誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的初步探討[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2003,23(6):446-449.

[15] 楊松梅,王湛,周玲,等.攜帶EBV-LMP2基因的DNA疫苗、腺相關(guān)病毒疫苗和腺病毒疫苗免疫小鼠的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答[J].生命科學(xué),2009,39(4):342-345.

[16] 王湛,周玲,吳小兵,等.Ad-LMP2重組腺病毒疫苗在恒河猴體內(nèi)免疫效果的研究[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2006,20(2):63-65.

[17] 莫武寧,周玲,吳小兵,等.rAd5F35-LMP2重組腺病毒疫苗免疫恒河猴誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2007,21(3):226-228.