沙蠶金屬蛋白酶體外抗凝血與溶栓作用

鄧志會(huì) 孫東升 李 波 肖 微 (齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目前，溶栓治療被認(rèn)為是治療血栓性疾病最為有效的方法，極大地降低了血栓性疾病的病死率和致殘率〔1〕;但這些藥物也存在一些缺點(diǎn)，如出血、過敏反應(yīng)及價(jià)格昂貴等〔2〕。因此，尋找和開發(fā)新型溶栓劑仍是治療血栓性疾病的重要內(nèi)容。生物體是溶栓劑的主要來源〔3～5〕。沙蠶是一種海洋無脊椎動(dòng)物，體內(nèi)含有多種纖維蛋白水解酶〔6，7〕。沙蠶金屬蛋白酶(NVMP)是從海洋生物沙蠶體內(nèi)分離純化的一種新型的具有纖溶活性的金屬蛋白酶，是一種分子量為28～32 kD的單鏈蛋白，等電聚焦電泳顯示其等電點(diǎn)為8.0〔8〕。本研究進(jìn)一步探討其在體外的溶栓和抗凝血作用及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 家兔購于我校動(dòng)物室;NVMP為本實(shí)驗(yàn)室前期制備的凍干品;牛血凝血酶和牛血纖維蛋白原購于中國藥品生物制品研究所;低分子量蛋白Marker購于Amersham Biosciences公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 抗凝血實(shí)驗(yàn) 家兔心臟取血。取4支滅菌小試管，分別加1 ml 0.9%NaCl(用 0.02 mol/L pH7.4 PBS 配制)，0.5、0.25、0.125 mg/ml的 NVMP(0.9%NaCl配制);然后每管加1 ml的血液，輕輕振蕩、混勻，置37℃恒溫水浴，定時(shí)觀察血液的凝固狀態(tài)。

1.3 血栓溶解率實(shí)驗(yàn) 家兔心臟取血，體外在培養(yǎng)皿內(nèi)自然凝固，制成實(shí)驗(yàn)性血栓。將血栓切割成大致相等的4份，分別稱重后依次加入4支滅菌試管內(nèi)，再依次加入0.9%NaCl 1 ml，NVMP 5.0 mg/ml和 2 mg/ml(0.9%NaCl 配制)。置37℃恒溫水浴，2 h后取出所有試管，小心取出血栓，并用濾紙條輕輕吸干血栓表面水分后，依次稱重。重復(fù)做三次，計(jì)算血栓溶解率。溶解率=(W－G)/W×100%，W:實(shí)驗(yàn)前血栓重量，G:實(shí)驗(yàn)后血栓重量。

1.4 纖維蛋白原水解活性分析 500 μg牛血纖維蛋白原和0.5 μg 純 化 的 NVMP 溶 解 在 500 μl 20 mmol/L Tris-HCl(pH7.4)緩沖液中，37℃恒溫孵育，在不同的時(shí)間間隔(0、1、3、5、10、30、60、120 min)取出一部分進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳分析(5%濃縮膠、10%分離膠)，觀察NVMP水解纖維蛋白原各亞基的先后順序。

1.5 纖維蛋白溶解方式 采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測(cè)NVMP溶解纖維蛋白的方式。瓊脂糖-纖維蛋白平板的鋪板方法參照蚓激酶的國家藥品標(biāo)準(zhǔn)〔9〕:鋪兩個(gè)瓊脂糖-纖維蛋白平板:一個(gè)為加熱平板，在制作過程中不加纖溶酶原，制備好的纖維蛋白平板放在恒溫干燥箱中80℃加熱30 min，滅活殘存在纖維蛋白原和凝血酶中的纖溶酶原和其他的促纖溶因子;另一個(gè)為不加熱平板，在制作過程中加入10 mU/L的纖溶酶原200 μl不加熱。每個(gè)平板打孔，加入10 μl的NVMP，37℃恒溫箱中孵育過夜，測(cè)量各加樣孔產(chǎn)生的溶圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 NVMP的抗凝血作用 加入0.9%NaCl的陰性對(duì)照組在37℃恒溫孵育10 min后就已經(jīng)凝固;加入0.125 mg/ml和0.25 mg/ml NVMP實(shí)驗(yàn)組在37℃孵育10 min時(shí)血液未凝固，在30 min時(shí)分別形成少量的小血凝塊，在1 h后血凝塊完全溶解，血液呈溶解狀態(tài);而加入0.5 mg/ml NVMP的實(shí)驗(yàn)組血液一直處于未凝固狀態(tài)。表明，NVMP具有明顯的抗凝血作用。

2.2 NVMP溶解血栓的效果 以兔新鮮血栓為材料，不同濃度的NVMP(0.125，0.25和0.5 mg/ml)在37℃恒溫條件下，作用2 h后血栓溶解率分別為(67.5±4.7)%，(79.7±6.7)%和(85.2±8.2)%;而0.9%NaCl對(duì)照組血栓溶解率僅為(12.3±1.9)%。結(jié)果表明，NVMP具有較強(qiáng)的血栓溶解作用，在較低濃度下(0.125 mg/ml)對(duì)血栓仍具有較好的溶栓效果，且隨NVMP濃度的增加溶解血栓的能力也逐漸增強(qiáng)。

2.3 NVMP水解纖維蛋白原的活性分析 將NVMP與牛血纖維蛋白原一起在37°C條件下作用，在不同的時(shí)間取出一部分進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果見圖1。NVMP最先水解牛血纖維蛋白原的Aα鏈，在1 min內(nèi)將其完全水解;然后牛血纖維蛋白原的Bβ鏈逐漸被水解，在作用30 min內(nèi)水解完全;γ鏈?zhǔn)亲詈蟊凰獾?，在作?20 min時(shí)被完全水解。說明NVMP具有降纖作用，而且水解纖維蛋白原各亞基的速度由快到慢的順序?yàn)锳α鏈、Bβ鏈、γ鏈。

圖1 SDS-PAGE電泳分析NVMP的纖維蛋白原水解活性

2.4 NVMP溶解纖維蛋白的方式 使用加熱和未加熱兩個(gè)瓊脂糖-纖維蛋白平板，觀察NVMP對(duì)纖維蛋白的水解作用，結(jié)果見圖2。在加熱和不加熱的纖維蛋白平板上，NVMP均產(chǎn)生明顯的溶圈，說明蛋白酶可以在沒有纖溶酶原的條件下，直接水解纖維蛋白;同時(shí)，富含纖溶酶原的不加熱平板上，蛋白酶產(chǎn)生的溶圈直徑略大于不含纖溶酶原的加熱平板，說明該蛋白酶也具有一定的激酶活性，可以通過激活纖溶酶原轉(zhuǎn)變成纖溶酶的方式，間接水解纖維蛋白，這種具有激酶和纖溶酶的雙重特性與蚓激酶相似，表明其具有較強(qiáng)的溶栓活性。

3 討論

纖維蛋白原在凝血酶的作用下轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，直接參與凝血過程;纖維蛋白原還可介導(dǎo)血小板聚集反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NVMP能夠快速地水解纖維蛋白原，具有降纖作用，進(jìn)而影響血液凝固過程，因此在體外表現(xiàn)出良好的抗凝血和抑制血栓形成的作用。NVMP的這種降纖作用是非常重要的，應(yīng)用于臨床時(shí)，它能夠降低全血和血漿黏度，增加血流速度，改善微循環(huán)，從而抑制血栓的形成和進(jìn)一步增大，預(yù)期對(duì)血栓性疾病會(huì)具有較好的臨床療效。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，NVMP具有直接水解纖維蛋白的活性，是一種纖維蛋白溶解酶;同時(shí)還具有激活纖溶酶原轉(zhuǎn)變成纖溶酶的激酶活性，因此在體外會(huì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的纖維蛋白溶解活性，能夠快速地溶解血栓。

圖2 NVMP的纖維蛋白水解活性分析

對(duì)于血栓性疾病，早期(6～12 h內(nèi))的溶栓和降纖是治療的重要手段。本研究表明，NVMP在體外具有明顯抗凝血、抑制血栓形成和溶解血栓的作用，且隨劑量增加作用有所增強(qiáng)。因此，有望將其開發(fā)成為新型的溶栓藥物。

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