溫針灸對(duì)慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸P物質(zhì)、血管活性腸肽表達(dá)的影響

孫彥輝 孫永輝 趙振栓 郭新宇 孫立虹 梁玉磊

(河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院針灸系，河北 石家莊 050091)

慢傳輸型便秘(STC)的相關(guān)發(fā)病因素眾多，但確切發(fā)病機(jī)制尚未明確，可能為一種病因產(chǎn)生多種機(jī)制所致，也可能由多種因素協(xié)同所致。溫針灸治療頑固性便秘被臨床廣泛應(yīng)用〔1，2〕，但根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，目前尚沒(méi)有對(duì)溫針灸治療STC機(jī)制的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)溫針灸對(duì)實(shí)驗(yàn)性STC大鼠結(jié)腸傳輸功能以及結(jié)腸P物質(zhì)(SP)和血管活性腸肽(VIP)的影響角度，探討溫針灸治療STC的部分作用機(jī)制，為臨床運(yùn)用溫針灸治療STC提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 選用健康成熟的清潔級(jí)SD大鼠100只，雌雄各半，體重(180～220)，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào):1006107)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用及操作方法均經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。華佗牌針灸針、艾絨(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);RM2125型切片機(jī)(德國(guó)Leica公司);圖像分析系統(tǒng)(德國(guó)Leica公司);復(fù)方地芬諾酯(河南省新鄉(xiāng)市常樂(lè)制藥廠)。SP、VIP免疫組化試劑盒(美國(guó)Zymed公司);一抗、二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.2 動(dòng)物模型及分組 參照文獻(xiàn)〔3〕，所有大鼠均分籠飼養(yǎng)，保持適宜的環(huán)境(16～25℃;相對(duì)濕度50% ～70%，清潔安靜)。飼料中添加復(fù)方地芬諾酯，劑量為8 mg/kg體重，每5日記錄1次大鼠大便粒數(shù)、大便干重及體重。飼養(yǎng)時(shí)間為120 d。隨機(jī)分為4組，隨機(jī)取10只為正常組，飼以普通干飼料，飼料由大學(xué)動(dòng)物研究所配制。其他3組造模，分別為模型組、針刺組、溫針組。

1.3 穴位選擇 天樞、足三里、支溝。穴位按照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》方法取穴，并參照人體有關(guān)穴位，以動(dòng)物比較學(xué)方法定位。針刺組在不作麻醉的情況下，將實(shí)驗(yàn)大鼠固定于自制束鼠器上，穴位常規(guī)消毒后，選用0.32 mm×15 mm毫針針刺，均采用捻轉(zhuǎn)手法(捻轉(zhuǎn)角度270°，捻轉(zhuǎn)頻率100次/min)行針1 min，每5分鐘行針1次，留針15 min，1次/d，連續(xù)針刺14 d。溫針組固定同上，穴位常規(guī)消毒后，用0.32 mm×15 mm毫針針刺，進(jìn)針后應(yīng)用捻轉(zhuǎn)手法，然后以艾絨置于針柄，予以溫針灸15 min，1次/d，連續(xù)針刺14 d。模型組、正常組用與針刺組、溫針組同樣的固定方法將實(shí)驗(yàn)大鼠在自制束鼠器上固定15 min，1次/d，連續(xù)14 d，此外不施加其他任何干預(yù)措施。

1.4 腸道傳輸功能測(cè)定 采用活性炭灌胃法測(cè)定首粒黑便排出時(shí)間。停止治療1 w后的大鼠禁食24 h，經(jīng)口灌入100 g/L活性炭懸液2 ml，從活性炭灌胃完畢開(kāi)始計(jì)時(shí)，記錄從灌胃到首粒黑便排出的時(shí)間。

1.5 免疫組化檢測(cè)結(jié)腸VIP、SP陽(yáng)性表達(dá) 大鼠動(dòng)脈放血處死，迅速剖腹取結(jié)腸中段腸管約2 cm，生理鹽水沖去腸內(nèi)容物，放入4%多聚甲醛固定約24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，干燥，二甲苯脫蠟，酒精梯度脫水，PBS洗3次，每次3 min;微波爐3檔20 min熱誘導(dǎo)修復(fù)，室溫自然冷卻，PBS洗3×3 min;0.3%H2O2抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶20 min，室溫;PBS洗3×3 min;20%正常羊血清室溫孵育30 min，不洗;滴加一抗(濃度1∶150)，37℃孵育2 h;在4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜，PBS洗3×3 min;加入生物素二抗，在37℃孵育2 h;PBS洗3×3 min;DAB顯色，HE輕度復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察，有棕黃染色者為SP物質(zhì)、VIP陽(yáng)性。采用全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)，對(duì)各組免疫組化切片進(jìn)行圖像分析。根據(jù)各組切片中的染色條件，在統(tǒng)一閾值下進(jìn)行。在200倍顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，測(cè)定各組在統(tǒng)一光度下陽(yáng)性細(xì)胞的陽(yáng)性面積百分比(目標(biāo)面積占統(tǒng)計(jì)場(chǎng)面積的百分比)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，各組間各參數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠結(jié)腸SP、VIP陽(yáng)性表達(dá) 與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸SP、VIP陽(yáng)性表達(dá)面積明顯降低(P＜0.01);與模型組比較，針刺組、溫針組大鼠結(jié)腸SP、VIP陽(yáng)性表達(dá)面積明顯升高(P＜0.01);與針刺組比較，溫針組大鼠SP陽(yáng)性表達(dá)面積明顯升高(P＜0.01)，但對(duì)VIP陽(yáng)性表達(dá)面積的影響兩組無(wú)差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠結(jié)腸SP、VIP陽(yáng)性表達(dá)的比較(±s)

表1 各組大鼠結(jié)腸SP、VIP陽(yáng)性表達(dá)的比較(±s)

與正常組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與模型組比較:3)P＜0.01;與針刺組比較:4)P＜0.01

組別 n SP(%) VIP(%)正常組10 25.74±5.20 26.88±5.45模型組 30 13.09±1.531) 12.42±2.501)針刺組 30 19.01±3.261)3) 20.96±4.971)3)溫針組 30 23.18±3.932)3)4) 23.17±4.722)3)

2.2 各組大鼠腸道傳輸功能 與正常組大鼠首粒黑便排出時(shí)間比較，模型組明顯延長(zhǎng)〔(631.63±107.11)vs(392.57±58.24)min，P＜0.01〕，說(shuō)明造模成功;針刺組、溫針組與模型組比較，STC大鼠首粒黑便排出時(shí)間明顯縮短〔(499.02±86.66)min vs(453.70±67.58)min，P ＜0.01〕，且溫針組較針刺組縮短明顯(P＜0.05)。

3 討論

結(jié)腸慢傳輸型便秘屬中醫(yī)“便秘”、“陰結(jié)”、“脾約”等范疇，與虛秘較為相近，常見(jiàn)于中老年人和女性患者。本病病位在大腸，但與肺、脾、腎三臟密切相關(guān)，關(guān)鍵病機(jī)在于脾虛，且虛實(shí)夾雜，以虛為主。脾失健運(yùn)、大腸傳導(dǎo)無(wú)力是STC發(fā)病的根本原因，而脾虛為其發(fā)病之本，大腸傳導(dǎo)無(wú)力為其發(fā)病之標(biāo)。何春梅等〔4〕提出氣虛而氣化不利、氣機(jī)郁滯是本病的病機(jī)，并針對(duì)其病機(jī)，應(yīng)用益氣開(kāi)秘法治療慢傳輸型便秘，取得良效。

溫針灸結(jié)合了針刺和灸法兩方面的作用，不僅有針刺的行氣導(dǎo)滯增強(qiáng)腸蠕動(dòng)，而且灸法又具有很好的扶正益氣作用。支溝穴可通利三焦氣機(jī)，為治療習(xí)慣性便秘的經(jīng)驗(yàn)效穴;天樞穴是大腸的募穴，《素問(wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》說(shuō):“陽(yáng)病治陰”，六腑病證多取募穴治療，能疏通經(jīng)絡(luò)，調(diào)和氣血，達(dá)到調(diào)整胃腸運(yùn)動(dòng)動(dòng)能的作用;足三里穴功可補(bǔ)益氣血，健脾和胃。故而選取支溝、足三里、天樞溫針灸法，共奏“補(bǔ)脾益氣，行氣導(dǎo)滯”之功。

由于結(jié)腸在有效地促使糞便排出體外方面具有重要作用，因此STC常被認(rèn)為是結(jié)腸動(dòng)力異常所致〔5〕。已有證據(jù)表明，神經(jīng)體液對(duì)腸動(dòng)力的調(diào)節(jié)是綜合性的，并按一定的程序進(jìn)行，涉及腸刺激肽類(包括SP、乙酰膽堿、胃動(dòng)素、膽囊收縮素、神經(jīng)降壓素)和腸抑制肽類(VIP、NO、生長(zhǎng)激素釋放抑制因子)的相互作用，腸多肽在釋放時(shí)間或釋放量上的異?？赡芨蓴_腸內(nèi)容物過(guò)消化道時(shí)的協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)〔6〕。結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能的調(diào)節(jié)依賴于中樞系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)、腸道神經(jīng)系統(tǒng)三者的調(diào)節(jié)。研究表明〔7〕，腦腸肽存在于腸道內(nèi)分泌細(xì)胞、腸道神經(jīng)系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，不僅可通過(guò)體液途徑或作為腸道神經(jīng)系統(tǒng)的遞質(zhì)在外周對(duì)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，還可以通過(guò)影響迷走神經(jīng)環(huán)路在中樞水平發(fā)揮作用。SP對(duì)平滑肌有很強(qiáng)的刺激收縮作用，并可能與結(jié)腸黏膜感覺(jué)有關(guān);VIP主要作用是舒張平滑肌及血管。兩者缺乏均影響結(jié)腸的有效推進(jìn)，從而導(dǎo)致STC發(fā)生。本文顯示，溫針灸結(jié)合了針刺和灸法的雙重作用，更能發(fā)揮其“扶正行氣”之功，對(duì)結(jié)腸STC“因虛致秘”的病機(jī)尤為適宜。

1 金 洵，王玲玲.針灸治療慢性生功能性便秘臨床思路〔J〕.上海針灸雜志，2008;27(8):35-7.

2 余衛(wèi)華，符文彬，戰(zhàn)曉農(nóng)，等.電溫灸器治療慢性功能性便秘的臨床觀察〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2009;29(6):1556.

3 劉海峰，何俊堂，汪興偉，等.慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸肌電變化機(jī)制〔J〕.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005;26(7):603-6.

4 何春梅，陸金根，曹永清.益氣開(kāi)秘方對(duì)結(jié)腸慢輸型便秘大鼠腸動(dòng)力和腸神經(jīng)肽的影響〔J〕.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2007;5(2):160-4.

5 Wald A.Slow transit constipation〔J〕.Curr Treat Options Gastroenterol，2002;5(4):279-83.

6 汪興偉，劉海峰，徐 梅，等.大黃對(duì)慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢膽堿能神經(jīng)的影響〔J〕.重慶醫(yī)學(xué)，2008;35(15):1685-9.

7 Degen LP，Phillips SF.Variability of gastrointestinal transit in healthy women and men〔J〕.Gut，1996;39(2):299-305.