卡托普利和氯沙坦對(duì)血管性癡呆模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡和蛋白表達(dá)的影響

黃新武 李 華 李國春 熊玉霞 張 紅 秦大蓮 (瀘州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理教研室，四川 瀘州 646000)

血管性癡呆(VD)不僅嚴(yán)重?fù)p害患者的健康，影響患者的生命質(zhì)量，也給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)，因此，積極探尋防治VD的有效途徑具有重要醫(yī)學(xué)價(jià)值和社會(huì)意義。有研究表明〔1〕，腦內(nèi)具有獨(dú)立的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)，其在VD發(fā)病中起重要作用?？ㄍ衅绽亲畛Ｓ玫囊环N血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)，可直接抑制ACE的活性，減少AngⅡ的生成;氯沙坦屬血管緊張素1型受體(AT1受體)阻滯藥，通過阻滯AT1受體對(duì)抗AngⅡ的作用。本研究復(fù)制大鼠VD模型，通過Morris水迷宮法觀察卡托普利和氯沙坦對(duì)VD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力有良好改善的作用〔2〕，本文對(duì)模型大鼠海馬細(xì)胞凋亡及Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的影響進(jìn)行研究，探討其改善VD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠60只，月齡＞24個(gè)月，體重(320±20)g。瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供，為一級(jí)合格動(dòng)物。

1.2 材料 卡托普利由汕頭金石制藥總廠生產(chǎn)，批號(hào)080505;氯沙坦鉀膠囊，由北京萬生藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào):20080903。凋亡TUNEL試劑盒購自美國ROSS公司，兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗Bax多克隆抗體、SABC、DAB染色試劑盒、蘇木素均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 VD大鼠模型制備及分組 隨機(jī)取40只大鼠，采用不同時(shí)點(diǎn)分別結(jié)扎左、右頸總動(dòng)脈制備VD模型〔3〕。術(shù)后4 w通過Morris水迷宮對(duì)制模大鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)定，篩選出學(xué)習(xí)記憶能力明顯障礙，制模不合格10只剔除，模型制備成功30只大鼠，并隨機(jī)分為3組，每組10只。根據(jù)藥品說明書常用量體重計(jì)算給藥劑量，卡托普利組，卡托普利予2.5 mg/kg，灌胃，1次/d，持續(xù)4 w;氯沙坦組:氯沙坦予2.0 mg/kg，灌胃，1次/d，持續(xù)4 w;模型組:等量生理鹽水灌胃;假手術(shù)組10只，雙側(cè)頸總動(dòng)脈不結(jié)扎，余同模型大鼠，予等量生理鹽水灌胃。

1.4 組織標(biāo)本處理 學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)定后將動(dòng)物給予4%多聚甲醛灌注30 min。斷頭取腦放入4% 多聚甲醛固定，依次酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Bcl-2、Bax的表達(dá) 參照Bcl-2、Bax試劑盒說明，按常規(guī)SABC法進(jìn)行，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。

1.6 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 參照TUNEL試劑盒說明進(jìn)行。

1.7 結(jié)果觀察 在顯微鏡下觀察每張切片TUNEL陽性細(xì)胞、Bcl-2、Bax免疫陽性細(xì)胞的表達(dá)情況，分析指標(biāo)運(yùn)用GD-10.0多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定，以灰度計(jì)算所選視野陽性染色的單位面積(陽性細(xì)胞的面積占所選整個(gè)視野面積的百分比)，每張切片取梗死灶邊緣區(qū)互不重疊的5個(gè)視野，其均值即為該標(biāo)本每個(gè)高倍鏡視野中陽性細(xì)胞的單位面積。

1.8 病理檢查 大腦中部冠狀切取3 mm大腦厚片，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切4 μm切片，HE染色。

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元凋亡情況 顯微鏡下觀察，TUNEL染色陽性凋亡神經(jīng)元的細(xì)胞核呈棕黃色，神經(jīng)元體積縮小，呈三角形或扇形，尼氏小體消失，核固縮深染，核內(nèi)染色質(zhì)濃聚，染色質(zhì)濃集于核周，呈新月形、環(huán)形、長條形、塊狀小體甚至形成核碎片。而陰性神經(jīng)元的胞核則不顯示黃色，神經(jīng)元形態(tài)正常。假手術(shù)組大鼠海馬組織中只有零星的凋亡神經(jīng)元;而模型組大鼠可見大量凋亡神經(jīng)元，呈成簇出現(xiàn)，與假手術(shù)組比較有顯著意義(P＜0.05)?？ㄍ衅绽M和氯沙坦組大鼠凋亡神經(jīng)元均明顯減少，與模型組比較有顯著意義(P＜0.05)。見表1，圖1。

2.2 海馬Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)情況 顯微鏡下觀察，各組大鼠海馬Bcl-2、Bax陽性神經(jīng)元染色均以胞漿有棕黃色物質(zhì)沉積為主，也有部分胞膜及核膜著色，并可顯示神經(jīng)元輪廓。Bcl-2陽性神經(jīng)元變性較輕，形態(tài)接近正常，胞體不腫脹，基本上呈橢圓形，邊緣較光滑。而Bax陽性神經(jīng)元變性較重，胞體形狀不規(guī)則，邊緣欠光滑。假手術(shù)組大鼠海馬Bcl-2、Bax均呈少量表達(dá)。模型組大鼠Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)均明顯增加，與假手術(shù)組比較有顯著意義(P＜0.05)?？ㄍ衅绽M和氯沙坦組大鼠Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)有明顯改善。見表1，圖2，圖3。

2.3 病理形態(tài)學(xué) 圖4可見HE染色后神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)淡紅色，核呈藍(lán)褐色。假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元排列整齊、密集，細(xì)胞完整、結(jié)構(gòu)正常，胞質(zhì)豐富;細(xì)胞核呈圓形、橢圓形，無變性，無固縮及溶解現(xiàn)象。模型組大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，排列紊亂，變性明顯，體積縮小，胞核與胞質(zhì)界限不清，核固縮成三角形或不規(guī)則形?？ㄍ衅绽M和氯沙坦組大鼠海馬缺血壞死較模型組大鼠明顯減輕。

表1 海馬神經(jīng)元凋亡及蛋白表達(dá)情況(%，±s，n=10)

表1 海馬神經(jīng)元凋亡及蛋白表達(dá)情況(%，±s，n=10)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 細(xì)胞凋亡 Bcl-2蛋白表達(dá) Bax 蛋白表達(dá)假手術(shù)組 4.38±1.342) 5.21±1.142) 3.61±1.552)卡托普利組 11.34±2.142) 23.41±2.171) 9.47±3.112)氯沙坦組 15.22±2.412) 21.53±2.731) 11.26±2.562)模型組 39.24±5.471) 20.08±3.171) 28.93±3.681)

圖1 各組海馬神經(jīng)元凋亡情況(×200)

圖2 海馬Bcl-2蛋白表達(dá)(DAB，×200)

圖3 海馬Bax蛋白表達(dá)情況(DAB，×200)

圖4 各組大鼠海馬病理形態(tài)學(xué)變化(HE，×100)

3 討論

細(xì)胞凋亡與許多疾病的發(fā)生有密切關(guān)系。細(xì)胞凋亡機(jī)制在VD研究中受到越來越重視。腦神經(jīng)元對(duì)凋亡損傷極其敏感，在腦缺血的病理過程中存在細(xì)胞凋亡這一病理機(jī)制?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，細(xì)胞凋亡的直接原因可能是凋亡細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的結(jié)果。其中 Bcl-2蛋白家族成員起著至關(guān)重要作用〔4〕。Bcl-2和Bax是其家族中調(diào)控細(xì)胞凋亡的兩個(gè)主要基因，Bcl-2從人淋巴細(xì)胞分離出來的具有阻抑細(xì)胞凋亡的1個(gè)原癌基因，它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作為1種有效的抑制神經(jīng)元凋亡和壞死的因子，可促進(jìn)神經(jīng)元的存活以及突觸的再生〔5〕。Bax蛋白是細(xì)胞凋亡的激動(dòng)劑〔6〕。Bax蛋白可自身形成同源二聚體，并易與Bcl-2蛋白形成異源二聚體復(fù)合物，Bcl-2表達(dá)相對(duì)增多時(shí)Bcl-2/bax二聚體增多，消除Bax的促凋亡效應(yīng)，而Bax表達(dá)相對(duì)增多時(shí)Bax/Bax二聚體增加，促凋亡作用上升。因此，一旦Bax蛋白大量表達(dá)時(shí)，細(xì)胞便走向死亡。研究結(jié)果顯示，VD模型組大鼠海馬可見大量成簇凋亡神經(jīng)元。模型組大鼠Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)均增加，但Bax蛋白表達(dá)似乎更明顯?？ㄍ衅绽M和氯沙坦組大鼠凋亡神經(jīng)元均明顯減少，Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)也有明顯改善。

病理檢查結(jié)果也顯示，VD模型組大鼠的海馬神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，缺血壞死明顯?？ㄍ衅绽M和氯沙坦組大鼠海馬缺血壞死明顯減輕。海馬是與認(rèn)知功能相關(guān)的重要腦區(qū)，是學(xué)習(xí)、記憶的高級(jí)中樞，它直接參與信息的貯存和處理。由于海馬神經(jīng)元的存活數(shù)量直接影響神經(jīng)元突觸的可塑性效應(yīng)，從而影響海馬對(duì)信息的處理和傳遞。因此，卡托普利和氯沙坦能減輕海馬神經(jīng)元大量凋亡丟失，可能是改善患者腦缺血后引起VD學(xué)習(xí)記憶障礙的重要機(jī)制之一。

1 Ciobica A，Bild W，Hritcu L，et al.Brain renin-angiotensin system in cognitive function:pre-clinical findings and implications for prevention and treatment of dementia〔J〕.Acta Neurol Belg，2009;109(3):171-6.

2 黃新武，李 華，秦大蓮，等.卡托普利和氯沙坦對(duì)血管性癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2010;12(6):497-8.

3 黃新武，李 華，秦大蓮，等.不同時(shí)點(diǎn)分別結(jié)扎左、右頸總動(dòng)脈建立大鼠血管性癡呆模型〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2010;30(14):2006-07.

4 Tsukahara S，Yamamoto S，Tin-Tin-Win-Shwe，et al.Inhalation of low-level formaldehyde increases the bcl-2/Bax expression ratio in the hippocampus of immunologically sensitized mice〔J〕.Neuroimmunomodulation，2006;13(2):63-8.

5 Wada A，Yokoo H，Yanagita T，et al.Lithium:potential therapeutics against acute brain injuries and chronic neurodegenerative diseases〔J〕.J Pharmacol Sci，2005;99(4):307-21.

6 Adams JM，Huang DC，Strasser A，et al.Subversion of the bcl-2 life/death switch in cancer development and therapy〔J〕.Cold Spring Harb Symp Quant Biol，2005;70:469-77.