黃連解毒湯對(duì)代謝綜合征大鼠心肌的保護(hù)作用及對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響

李曉星 包成梅 李傳保 季曉平 (山東大學(xué)齊魯醫(yī)院干部保健科，山東 濟(jì)南 500)

代謝綜合征(MS)是以糖代謝異常、高血壓、血脂紊亂、中心型肥胖等多種代謝紊亂或危險(xiǎn)因素聚集一體的臨床癥候群，胰島素抵抗在MS的發(fā)病機(jī)制中處于中心地位。黃連解毒湯是清熱解毒經(jīng)典方劑，由黃連、黃岑、黃柏、桅子四味生藥組成。系統(tǒng)研究表明，黃連解毒湯具有降糖、調(diào)脂、抗炎、改善胰島素抵抗等作用〔1，2〕。本研究以高糖、高脂結(jié)合高鹽飲食建立MS大鼠模型，旨在觀(guān)察MS大鼠肌損傷的特點(diǎn)，評(píng)價(jià)黃連解毒湯對(duì)核因子-κB(NF-κB)表達(dá)及胰島素受體底物1(IRS-1)絲氨酸磷酸化水平的影響，從而為闡明黃連解毒湯保護(hù)MS大鼠心肌的機(jī)制，提供重要的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物與試劑 黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子按3∶2∶2∶2比例組成，其藥材均購(gòu)于濟(jì)南建聯(lián)中藥，煎煮取汁，濃縮成清膏。取清膏送山東大學(xué)齊魯醫(yī)院藥劑科以薄層掃描方法測(cè)得其所含鹽酸小檗堿為18 mg/g;黃連解毒湯清膏臨用前以PBS溶液(pH 7.4)配成含鹽酸小檗堿37.4 g/L的混懸液;胰島素放射免疫分析試劑盒購(gòu)自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司;血糖、甘油三酯(TG)酶免試劑盒購(gòu)自羅氏公司。一抗為美國(guó)Cell signal公司產(chǎn)品，二抗購(gòu)于北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物及分組 雄性6周齡Wistar大鼠65只，均購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為兩組:正常對(duì)照組(NC組，n=10)，模型組(n=55)。NC組給予標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料及普通飲水喂養(yǎng)，模型組給予高糖、高脂及高鹽飼料及20%高蔗糖水喂養(yǎng)(HF飲食)。HF飲食喂養(yǎng)16 w后，將成模的其中21只大鼠隨機(jī)分為MS組(n=10)和黃連解毒湯組(MS+H組，n=11)。此后12 w，MS+H組繼續(xù)給予HF飲食同時(shí)每天以黃連解毒湯0.5 ml/100 g灌胃;MS組繼續(xù)給予HF飲食同時(shí)每天以等量生理鹽水灌胃;NC組繼續(xù)給予標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料及普通飲水喂養(yǎng)同時(shí)每天以等量生理鹽水灌胃。

1.3 生化指標(biāo)的檢測(cè) 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每2周稱(chēng)量體重(BW)及測(cè)尾動(dòng)脈收縮期血壓(SBP)1次;分別于造模前、HF飲食喂養(yǎng)16 w、實(shí)驗(yàn)?zāi)┏槿§o脈血測(cè)定空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、總膽固醇(TC)、TG。血清胰島素用放免法測(cè)定，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 組織學(xué)觀(guān)察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死動(dòng)物，留取心臟標(biāo)本，以10%中性甲醛溶液固定24 h，取固定后心肌組織，梯度酒精系列脫水，常規(guī)石蠟包埋切片，行天狼猩紅染色。光鏡下觀(guān)察膠原纖維，拍片，掃描。

1.5 透射電鏡觀(guān)察 留取心臟標(biāo)本，用4℃預(yù)冷的2%戊二醛固定液固定，再以鋨酸后固定，取固定后心肌組織經(jīng)脫水、浸透、包埋后制備超薄切片，在透射電鏡下，觀(guān)察心肌組織超微結(jié)構(gòu)的變化，選取典型視野拍照。

1.6 Western印跡法檢測(cè)各蛋白的表達(dá) 每20 mg心肌組織置于培養(yǎng)皿中，手術(shù)剪剪碎成細(xì)小碎片(冰上進(jìn)行);組織中加入細(xì)胞裂解液，混勻。每20 mg組織加入200 μl裂解液，1 μl PMSF;將組織充分勻漿裂解，冰浴 20 min;離心10 000～14 000 r/min，4℃離心5 min;取上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中，即為全蛋白提取物，蛋白定量;分裝保存于－70℃，避免反復(fù)凍融。配膠，將蛋白質(zhì)Marker與待測(cè)樣品一次上樣，行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳;待染料到達(dá)分離膠底部，斷開(kāi)電源，行蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移，200 mA恒流轉(zhuǎn)移3 h。取出電轉(zhuǎn)移完畢的硝纖膜至10 ml 5%脫脂奶粉封閉液中，室溫下?lián)u床搖2 h。用抗體稀釋液分別稀釋 β-actin抗體(1∶1 000)，NF-κB P65抗體(1∶500)，磷酸化 IRS-1(Ser307)抗體(1∶1 000)，磷酸化 Akt抗體(1∶1 000);將硝纖膜浸入一抗溶液的培養(yǎng)皿中，室溫震蕩2 h(或4℃反應(yīng)過(guò)夜)。根據(jù)一抗選用合適的二抗，用5%脫脂奶粉封閉液分別配制二抗反應(yīng)液(1∶3 000～1∶20 000)。二抗反應(yīng)過(guò)后，取出膜于1×TBST溶液中漂洗，10 min×3次。

將上述反應(yīng)過(guò)后的硝纖膜進(jìn)行放射自顯影處理。應(yīng)用生物凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)(AlphaImager 2200)掃描定量，計(jì)算各組目的蛋白相對(duì)于β-actin的相對(duì)光密度值作為各蛋白的相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重、血壓比較 見(jiàn)表1、圖1。各組大鼠在基礎(chǔ)狀態(tài)時(shí)BW、SBP無(wú)明顯差異，但在HF飲食喂養(yǎng)16 w后，MS組大鼠BW、SBP明顯高于NC組，用藥物干預(yù)12 w后，MS+H組BW及SBP明顯低于MS組(P＜0.05，P＜0.01)。

表1 實(shí)驗(yàn)?zāi)└鹘M大鼠體重、血壓及生化指標(biāo)比較(±s)

表1 實(shí)驗(yàn)?zāi)└鹘M大鼠體重、血壓及生化指標(biāo)比較(±s)

與NC組比較:1)P＜0.01;與MS組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別 BW(g) SBP(mmol/L) FBG(mmol/L) FINS(μIU/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L)NC組(n=10) 567.50±28.28 102.35±4.38 5.48±0.48 17.68±5.21 0.73±0.26 1.60±0.17 MS組(n=10) 661.78±26.711) 139.80±6.921) 8.51±0.991) 35.85±10.451) 0.91±0.26 2.04±0.151)MS+H組(n=11) 552.35±34.563) 128.00±7.313) 6.53±0.983) 23.86±8.512) 0.75±0.30 1.90±0.302)

圖1 MS大鼠與NC大鼠不同周齡體重、血壓比較

2.2 生化指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。藥物干預(yù)前，與NC組比較，MS組及MS+H組大鼠FBG、FINS及TC升高(P＜0.01);藥物干預(yù)12 w后，與MS組比較，MS+H組FBG、FINS明顯下降(P＜0.05);MS+H組TC水平明顯下降(P＜0.05)。

2.3 天狼猩紅染色結(jié)果 見(jiàn)圖2。偏振光鏡下可見(jiàn)膠原纖維呈紅色，與NC組相比，MS組心肌間質(zhì)膠原纖維明顯增多;MS+H組較MS組心肌間質(zhì)膠原纖維明顯減少。

2.4 透射電鏡觀(guān)察結(jié)果 見(jiàn)圖3。NC組左室心肌組織細(xì)胞排列整齊;粗細(xì)肌絲排列整齊，肌小節(jié)及明暗各帶清晰可見(jiàn);線(xiàn)粒體豐富、大小均一、圓形或橢圓形;MS組左室心肌組織細(xì)胞部分肌節(jié)寬窄不一，肌絲排列紊亂;線(xiàn)粒體明顯增多，腫脹，可見(jiàn)指紋狀線(xiàn)粒體(箭頭所示);MS+H組大鼠左室心肌組織總體較MS組明顯好轉(zhuǎn)，細(xì)胞排列較整齊;線(xiàn)粒體大小較一致，排列較規(guī)整，未見(jiàn)指紋狀線(xiàn)粒體。

圖2 各組大鼠心肌組織天狼猩紅染色(×400)

圖3 各組大鼠心肌組織透射電鏡結(jié)果(×1 000)

2.5 Western印跡檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖4。與NC組比較，MS組蛋白NF-κB含量明顯升高(P＜0.05);絲氨酸磷酸化IRS-1(PIRS-1)水平明顯升高(P＜0.01);磷酸化Akt(P-Akt)水平明顯降低(P＜0.01);與MS組比較MS+H組蛋白NF-κB表達(dá)明顯降低(P＜0.01);MS+H組P-IRS-1表達(dá)明顯降低(P＜0.05);MS+H組P-Akt表達(dá)明顯升高(P＜0.01)。

圖4 各組大鼠心肌組織NF-κB、P-IRS-1及P-Akt蛋白水平比較

3 討論

黃連解毒湯出自唐·王燾所著《外臺(tái)秘要》，由黃連、黃芩、黃柏、梔子4味中藥按3∶2∶2∶3比例配伍組成，其中以黃連瀉心火、兼瀉中焦之火為君;黃芩清肺熱、瀉上焦之火為臣;黃柏瀉下焦之火，梔子通瀉三焦之火，導(dǎo)熱下行，合為佐使，共以收瀉火解毒之功，無(wú)論內(nèi)服、外服，均有良好的治療作用〔3〕。方素萍等〔4〕研究表明，黃連解毒湯含藥血清不僅能抑制非致炎狀態(tài)下中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，而且能抑制致炎因子所誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附作用增強(qiáng)，這可能是其抗炎作用機(jī)制之一。同樣有研究表明黃連解毒湯能夠抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展〔5〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，黃連解毒湯中的重要成分小檗堿能改善心肌肥厚大鼠異常的心功能，抑制心肌細(xì)胞增生，阻止壓力負(fù)荷過(guò)重而引起的心肌肥厚的發(fā)展〔6，7〕。本研究進(jìn)一步證明黃連解毒湯對(duì)MS大鼠心肌的保護(hù)作用及其改善胰島素抵抗的機(jī)制。

MS所有組成成分都是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這些與代謝有關(guān)的多種疾病或致病因素同時(shí)出現(xiàn)在一個(gè)個(gè)體身上，其臨床預(yù)后不良的危險(xiǎn)大于僅有一種危險(xiǎn)因素患者，而且其效應(yīng)不是簡(jiǎn)單相加，而是協(xié)同加劇，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康〔8〕。糖脂代謝紊亂是導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能改變的重要原因。而改善IRS/PI3K/Akt通路進(jìn)而改善糖脂代謝，具有重要的保護(hù)心臟結(jié)構(gòu)和功能的作用。本結(jié)果提示HF飲食喂養(yǎng)28 w MS大鼠出現(xiàn)明顯的心肌損傷結(jié)構(gòu)改變。黃連解毒湯對(duì)MS大鼠心肌起到明顯的保護(hù)作用。

IR是MS發(fā)病的中心環(huán)節(jié)之一，生理情況下，胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路為:胰島素與胰島素受體結(jié)合-胰島素受體磷酸化-胰島素受體底物(IRS)酪氨酸磷酸化-激活其下游底物-胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至效應(yīng)器。MS是一種全身慢性系統(tǒng)性的低度炎癥狀態(tài)，炎癥反應(yīng)在MS發(fā)生發(fā)展中起重要作用，炎癥是引起胰島素抵抗的病理生理基礎(chǔ)〔9〕。胰島素受體后的信號(hào)通路與炎癥因子的信號(hào)傳導(dǎo)存在交叉作用，導(dǎo)致IR的主要分子機(jī)制是非特異性炎癥所產(chǎn)生的炎癥因子干擾胰島素受體底物/磷脂酰肌醇-3-激酶(IRS/PI3K)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路〔10〕。體外實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)至少有8種激酶使IRS的絲氨酸磷酸化，炎性因子TNF-α、IL-6等均可激活這些激酶。干擾胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激酶包括c-jun氨基末端激酶、核因子-κB(NF-κB)抑制物激酶(IKK)、蛋白激酶 C和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白等〔11，12〕。目前研究較多的是導(dǎo)致胰島素抵抗的三條途徑，即IKK/NF-κB、JNK、SOCS-3。本研究結(jié)果顯示，MS組大鼠心肌組織中NF-κB蛋白表達(dá)增多，間接證實(shí)炎癥在MS大鼠心肌中的啟動(dòng);MS大鼠心肌組織中存在炎癥的激活，使得IRS307位點(diǎn)的絲氨酸磷酸化增強(qiáng)，阻礙IRS正常的酪氨酸磷酸化，進(jìn)而影響胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路。給予黃連解毒湯后，炎癥激活受抑制，胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路正常發(fā)揮作用，進(jìn)而起到保護(hù)心肌結(jié)構(gòu)和功能的作用。

1 冷三華，陸付耳，屠慶年，等.黃連解毒湯對(duì)2型糖尿病大鼠血糖和血脂代謝的影響〔J〕.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2003;9(4):43-5.

2 葉愛(ài)麗，陸付耳，徐麗君.黃連解毒湯對(duì)胰島素抵抗大鼠脂肪組織胰島素受體及其底物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響〔J〕.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006;26(10):909-12.

3 劉 磊，姜 鵬，竇圣姍，等.黃連解毒湯的化學(xué)及藥理學(xué)研究進(jìn)展〔J〕.中草藥，2008;39(6):935-8.

4 方素萍，邱全瑛，郝 鈺.黃連解毒湯含藥血清對(duì)LPS/TNF-a誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間黏附的影響〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2001;7(2):31-3.

5 Sekiya N，Kainuma M，Hikiami H，et al.Oren-gedoku-to and Keishi-bukuryo-gan-ryo inhibit the progression of atherosclerosis in diet-induced hypercholesterolemic rabbits〔J〕.Biol Pharm Bull，2005;28(2):294-8.

6 Hong Y，Hui SC，Chan TY，et al.Effect of berberine on regression of pressure overload induced cardiac hypertrophy in rats〔J〕.Am J Clin Med，2002;30(4):589-99.

7 Li XX，Li CB，Ji XP，et al.Huang-Lian-Jie-Du-Tang inhibits myocardial remodeling in a rat model of metabolic syndrome〔J〕.J Ethnopharmacol，2008;119(2):259-65.

8 Gupta S，Gupta BM.Metabolic syndrome:diabetes and cardiovascular disease〔J〕.Indian Heart J，2006;58(2):149-52.

9 Ridker PM，Buring JE，Cook NR，et al.C-reactive protein，the metabolic syndrome，and risk of incident cardiovascular events:an 8-year follow-up of 14 719 initially healthy American women〔J〕.Circulation，2003;107(3):391-7.

10 Ferré P.Insulin signaling and insulin resistance〔J〕.Therapie，2007;62(4):277-84.

11 Yuan M，Konstantopoulos N，Lee J，et al.Reversal of obesity-and diet-induced insulin resistance with salicylates or targeted disruption of Ikkbeta〔J〕.Science，2001;293(5535):1673-7.

12 Lamb RE，Goldstein BJ.Modulating an oxidative-inflammatory cascade:potential new treatment strategy for improving glucose metabolism，insulin resistance，and vascular function〔J〕.Int J Clin Pract，2008;62(7):1087-95.