糖皮質(zhì)激素對(duì)哮喘小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和TLR4表達(dá)的影響

龐 英，李 敏，張劍波，姚 斌

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院a.兒科，b.醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610072)

支氣管哮喘是兒童時(shí)期常見的慢性呼吸道疾病，越來(lái)越多的研究表明，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tr)在哮喘的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［1］，且CD4+CD25+Tr自身存在多種 Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)表達(dá)，TLR信號(hào)可以直接影響其功能［2］。本研究通過(guò)建立哮喘小鼠動(dòng)物模型，探討CD4+CD25+Tr及該細(xì)胞上的TLR4的表達(dá)在哮喘發(fā)病中的變化，并觀察糖皮質(zhì)激素對(duì)其影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 雌性BALB/c小鼠30只，SPF級(jí)，6～8周齡，體重(22.12±2.52)g，購(gòu)于四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，按隨機(jī)數(shù)字表法分為三組:正常對(duì)照組(NS組)、哮喘組(OVA組)和哮喘糖皮質(zhì)激素治療組(OVA/GC組)各10只，分籠飼養(yǎng)，喂食不含致敏原的特殊飼料。

1.2 儀器與試劑 主要實(shí)驗(yàn)儀器有低速離心機(jī)，由科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司提供;壓縮霧化吸入器，由臺(tái)灣雅博股份有限公司提供;CYTOMICSFC500流式細(xì)胞儀由美國(guó)BACK MAN COULTER公司提供等。主要實(shí)驗(yàn)試劑包括雞卵蛋白，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;氫氧化鋁(分析純)，購(gòu)于成都天成化學(xué)試劑廠;小鼠淋巴細(xì)胞分離液，購(gòu)于天津TDB生物技術(shù)發(fā)展中心;Anti-Mouse CD4 PE-Cy5、Anti-Mouse CD25 PE、Anti-Mouse CD284(TLR4)AlexaFluor 488及相應(yīng)同型對(duì)照等，購(gòu)于美國(guó)eBioscience公司。按操作說(shuō)明書進(jìn)行操作和配制。

1.3 動(dòng)物模型制備 參照沈華浩等［3］和 Sakai等［4］提出的方法略加調(diào)整制備哮喘動(dòng)物模型。即分別于實(shí)驗(yàn)當(dāng)日和第14天NS組予以生理鹽水0.2 ml腹腔注射，OVA組、OVA/GC組小鼠采用腹腔注射OVA/Al(OH)3混合液致敏0.2 ml(含OVA 100 μg，AL(OH)32 mg);從實(shí)驗(yàn)第21天起開始，NS組用37℃生理鹽水霧化吸入30 min，OVA組、OVA/GC組以2%OVA每天霧化30 min，連續(xù)霧化5天激發(fā)制備哮喘模型，OVA/GC組于每次激發(fā)前30 min腹腔注射地塞米松(1 mg/kg)。

1.4 分離脾單個(gè)核細(xì)胞 末次激發(fā)后24 h引頸處死小鼠。取出脾臟，剪成1～2 mm大小的小塊置于不銹鋼細(xì)胞篩上研磨、過(guò)濾后，采用密度梯度離心法分離制備脾組織單個(gè)核細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為106個(gè)細(xì)胞/ml，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組CD4+CD25+Tr占CD4+T細(xì)胞的百分率及CD4+CD25+Tr上的TLR4平均熒光強(qiáng)度。

1.5 肺組織病理切片制備 取出小鼠左肺，投入4%多聚甲醛溶液中固定48 h，經(jīng)脫水與透明、石蠟包埋，切成5 μm厚薄片，HE染色，觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及炎癥情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析;兩變量間相關(guān)性采用直線相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理改變 OVA組小鼠霧化過(guò)程中出現(xiàn)了明顯的類似人類哮喘急性發(fā)作癥狀:煩躁不安、抓耳撓腮或安靜少動(dòng)、呼吸加快加深、口唇紫紺、二便失禁等癥狀，哮喘地塞米松治療組上述癥狀明顯減輕，生理鹽水對(duì)照組除可見煩躁不安，無(wú)其他上述表現(xiàn)。肺部病理表現(xiàn)見圖1。

圖1 肺組織病理切片(HE染色，×200)a:NS組氣道及血管周圍未見炎癥改變;b:OVA組氣道及血管周圍均可見灶狀以嗜酸性粒細(xì)胞增多為主炎性細(xì)胞浸潤(rùn);c:OVA/GC組炎癥較OVA組明顯減輕

2.2 各組小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞CD4+CD25+Tr百分率及該細(xì)胞上表達(dá)的TLR4平均熒光強(qiáng)度值變化見表1。OVA組小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞CD4+CD25+Tr百分率明顯降低(P＜0.01)，但該細(xì)胞上表達(dá)的TLR4平均熒光強(qiáng)度值較NS組無(wú)明顯差異(P＞0.05);糖皮質(zhì)激素干預(yù)后哮喘小鼠CD4+CD25+Tr百分率及該細(xì)胞上表達(dá)的TLR4平均熒光強(qiáng)度明顯升高(P＜0.01)，而升高后的CD4+CD25+Tr百分率略高于 NS組小鼠，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞CD4+CD25+Tr百分率及該細(xì)胞上的TLR4平均熒光強(qiáng)度比較

2.3 各組脾單個(gè)核細(xì)胞CD4+CD25+Tr表達(dá)的TLR4平均熒光強(qiáng)度值與CD4+CD25+Tr百分率相關(guān)性分析 數(shù)據(jù)資料正態(tài)分布，pearson相關(guān)分析結(jié)果表明，NS組、OVA組和OVA/GC組小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞CD4+CD25+Tr上表達(dá)的TLR4平均熒光強(qiáng)度值與CD4+CD25+Tr百分率均無(wú)相關(guān)性，r分別為:0.282，0.365，0.356，均 P ＞ 0.05。

3 討論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Tr細(xì)胞是維持外周免疫耐受的關(guān)鍵細(xì)胞，在哮喘的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［1］。本實(shí)驗(yàn)中哮喘小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞CD4+CD25+Tr細(xì)胞百分率較對(duì)照組小鼠明顯降低，與我們前期報(bào)道一致［6］。進(jìn)一步證實(shí)了哮喘小鼠確實(shí)存在CD4+CD25+Tr細(xì)胞數(shù)量不足，可能減弱了對(duì)Th2細(xì)胞的接觸性抑制作用，使Th2型免疫反應(yīng)增強(qiáng)，導(dǎo)致機(jī)體全身和局部免疫紊亂，造成哮喘過(guò)敏性氣道炎癥的發(fā)生。

TLR4是一種模式識(shí)別受體。它通過(guò)病原體相關(guān)的分子模式釋放細(xì)胞因子可誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)成熟、促進(jìn)T細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞反應(yīng)，從而在哮喘免疫和宿主保護(hù)中起重要作用［7］。Carmalho等［2］發(fā)現(xiàn) Tr有 TLR4、5、7、8 表達(dá)，用 LPS 體外刺激CD4+CD25+Tr上的TLR4可直接誘導(dǎo)CD4+CD25+T細(xì)胞存活和增殖反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘模型小鼠與正常小鼠CD4+CD25+Tr上的TLR4平均熒光強(qiáng)度值無(wú)明顯差異;分析原因考慮可能與OVA不是TLR4的配體，不能刺激TLR4的表達(dá)有關(guān)。

糖皮質(zhì)激素是治療和控制哮喘最有效及首選藥物。本研究發(fā)現(xiàn) OVA/GC組小鼠脾臟 CD4+CD25+Tr百分率較OVA組明顯增加。與我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［6］。提示糖皮質(zhì)激素可通過(guò)調(diào)節(jié)哮喘體內(nèi)CD4+CD25+Tr數(shù)量，改善其免疫抑制功能，從而發(fā)揮治療作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示糖皮質(zhì)激素治療哮喘小鼠后CD4+CD25+Tr上的TLR4平均熒光強(qiáng)度表達(dá)較未治療的哮喘模型小鼠明顯增高。提示糖皮質(zhì)激素可促進(jìn)CD4+CD25+Tr上的TLR4的表達(dá)，其機(jī)制目前尚不十分清楚，相關(guān)報(bào)道不多。有資料提示，熱休克蛋白90為 TLR4的配體［9］，糖皮質(zhì)激素作用過(guò)程中解離的熱休克蛋白90可能促進(jìn)了CD4+CD25+Tr上的TLR4的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，OVA組小鼠CD4+CD25+Tr百分率較正常明顯下降，但其表達(dá)的TLR4平均熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化;OVA/GC組CD4+CD25+Tr上的TLR4表達(dá)與CD4+CD25+Tr的百分率無(wú)相關(guān)性。原因考慮為CD4+CD25+Tr上的TLR4未參與OVA誘發(fā)哮喘的發(fā)病機(jī)制;Moser等［10］發(fā)現(xiàn)，地塞米松作用后的DC對(duì)T細(xì)胞的多次重復(fù)刺激可以誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+Tr。提示糖皮質(zhì)激素可能除直接促進(jìn)CD4+CD25+Tr上的TLR4表達(dá)外還可能通過(guò)對(duì)DC的作用，而誘導(dǎo)CD4+CD25+Tr的產(chǎn)生。因此，糖皮質(zhì)激素對(duì)CD4+CD25+Tr增殖的調(diào)節(jié)可能是多種免疫細(xì)胞共同參與的結(jié)果，促進(jìn)CD4+CD25+Tr上TLR4的表達(dá)而增加CD4+CD25+Tr數(shù)量可能只是糖皮質(zhì)激素促進(jìn)CD4+CD25+Tr數(shù)量增加的其中一個(gè)部分。

綜上所述，CD4+CD25+Tr數(shù)目的減少，可能減弱對(duì)Th2細(xì)胞的接觸性抑制作用，使Th2型免疫反應(yīng)增強(qiáng)，造成哮喘過(guò)敏性氣道炎癥的發(fā)生，這可能是哮喘發(fā)病的機(jī)制之一。而CD4+CD25+Tr上的TLR4對(duì)OVA誘發(fā)哮喘的發(fā)病沒有作用;當(dāng)糖皮質(zhì)激素治療后，可使體內(nèi)的 CD4+CD25+Tr數(shù)量和TLR4表達(dá)明顯增加，這可能是糖皮質(zhì)激素發(fā)揮免疫抑制作用的機(jī)制之一。因此，進(jìn)一步研究TLR4與CD4+CD25+Tr在哮喘發(fā)病中的作用機(jī)制，將有助于闡明哮喘的免疫發(fā)病機(jī)制，為今后哮喘的免疫治療提供理論基礎(chǔ)。

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