MicroRNAs與可卡因成癮關(guān)系的研究進展*

王芬芬，沈 杰，張吉翔，3△

(南昌大學1第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，2第二附屬醫(yī)院教學管理辦公室，3江西省分子醫(yī)學重點實驗室，江西 南昌 330006)

可卡因進入體內(nèi)會導致海馬、前額葉皮層、中腦腹側(cè)被蓋區(qū)及伏隔核等學習記憶相關(guān)腦區(qū)的多巴胺、谷氨酸、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)等神經(jīng)遞質(zhì)釋放的異常變化，通過作用于相應(yīng)的受體引發(fā)一系列分子事件:包括激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路，改變神經(jīng)營養(yǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子、即刻早期基因或染色體的結(jié)構(gòu)等，并最終引起突觸的可塑性，甚至神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導致成癮形成。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，過度攝取可卡因后將誘導一類微小RNAs(microRNAs，miRNAs)轉(zhuǎn)錄或翻譯水平的改變，這一分子事件對可卡因成癮的形成具有重要調(diào)節(jié)作用，包括促進和抑制作用。深入研究miRNAs與可卡因成癮形成之間的內(nèi)在聯(lián)系及具體調(diào)節(jié)機制，將為治療可卡因成癮提供一條全新的途徑。本文就miRNAs的結(jié)構(gòu)、分布、功能及不同miRNAs在可卡因成癮形成過程中的具體調(diào)控機制等作一綜述。

1 miRNAs的結(jié)構(gòu)、分布及功能

miRNAs是一種長度為18～24核苷酸單鏈的內(nèi)源性非編碼小RNA，在進化過程中高度保守，通過與靶基因mRNA的3'非編碼區(qū)(3'-untranslated region，3'UTR)的結(jié)合位點(miRNA binding site)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達，參與細胞增殖、凋亡、分化、代謝、發(fā)育等多種生物學過程［1］。miRNAs可以從多個層面發(fā)揮調(diào)控基因表達的作用:(1)與靶基因3'UTR結(jié)合，抑制靶基因的翻譯;(2)與靶基因3'UTR結(jié)合，引起靶基因mRNA的降解;(3)誘導基因組特定區(qū)域組蛋白的甲基化，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活性。人大約有1000多個miRNAs［2］，研究分析表明，人類絕大多數(shù)基因受miRNAs的調(diào)控［3-4］。哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中存在大量的miRNAs，其中約有70% 可在腦組織中表達;神經(jīng)系統(tǒng)中miRNAs呈現(xiàn)出高時序性、高保守性和高特異性的表達方式，參與調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育、神經(jīng)元分化、突觸可塑性及高級神經(jīng)功能(如生物鐘、記憶、學習)等［5］。最新研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs可以改變某些可卡因成癮相關(guān)基因的表達、減弱或增強可卡因產(chǎn)生的獎賞效應(yīng)，從而調(diào)控可卡因成癮的形成。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與可卡因成癮相關(guān)的miRNAs有:miR-212、miR-132、miR-124、let-7d、miR-181a及 Ago2 依賴型 miRNAs(Ago2-dependent，induced by cocaine and Drd2-enriched miRNAs，ADICD miRNAs)等，它們通過多種途徑參與可卡因成癮的調(diào)控過程。

2 miRNA與可卡因成癮

2.1 miR-212、miR-132與可卡因成癮 miR-212位于人類第17號染色體短臂17p13.3-D片段上，主要分布于紋狀體、伏隔核區(qū)、海馬區(qū)、中腦腹側(cè)被蓋區(qū)以及小腦等處［6］。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的100多個miR-212靶基因中，與可卡因成癮相關(guān)的有Sprouty相關(guān)細胞膜蛋白(Sprouty-related with EVH1 domain-containing protein 1，SPRED1)基因［7］。miR-132 是與 miR-212受同一順式調(diào)控元件控制，從同一個多順反子轉(zhuǎn)錄前體加工成熟的miRNA;它們在基因組上呈串聯(lián)排列，成簇分布［8］。

Hollander等［7］發(fā)現(xiàn)急性可卡因給藥會誘導大鼠紋狀體中miR-212和miR-132表達上調(diào)，表明miR-212和miR-132與可卡因成癮有一定關(guān)系。隨后他們進行了更深入的研究，結(jié)果顯示:與短時用藥(1 h 0.5 mg/kg每天自身給藥)訓練和正常對照組相比，長時用藥(6 h 0.5 mg/kg每天自身給藥)反復訓練會導致大鼠截然不同的行為表現(xiàn)以及某些基因表達水平的差異。如長時可卡因用藥訓練大鼠行為上表現(xiàn)出可卡因攝入量隨訓練次數(shù)增加而增加，而短時用藥訓練大鼠可卡因攝入量始終保持恒定水平，前者的總攝入量也明顯高于后者;同時，長時用藥訓練大鼠覓藥動機比短時用藥組和對照組大鼠更高;此外，長時給藥訓練組大鼠紋狀體中miR-212和miR-132的表達明顯升高，表達量約為1.4倍短時訓練組以及1.75倍對照組。用反義寡核苷酸特異性減少大鼠紋狀體中miR-212的表達不影響miR-132的表達，發(fā)現(xiàn)長時給藥訓練組大鼠可卡因攝入量明顯增加，而短時給藥訓練組和對照組大鼠可卡因攝入量無明顯差異;此時，長時給藥訓練組大鼠對可卡因的渴求明顯高于短時給藥組和對照組。以上結(jié)果提示我們，只有當機體攝入一定劑量可卡因后，所產(chǎn)生的獎賞效應(yīng)才足以刺激紋狀體中的miR-212和miR-132過度表達。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，miR-212是通過放大cAMP反應(yīng)序列結(jié)合蛋白 (cAMP-responsive element binding protein，CREB)信號途徑而發(fā)揮其抗可卡因成癮的功能。

1987年，Montminy等發(fā)現(xiàn)有一種分子量約為43 kD的蛋白質(zhì)可與生長抑素基因的cAMP反應(yīng)元件(cAMP response element，CRE)有高度親和力，于是命名為CREB。CREB是cAMP通路下游的一種核轉(zhuǎn)錄因子，具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，分別與它們的DNA結(jié)合活性和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性有關(guān)。其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域中133位的絲氨酸殘基可被蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、Ca2+/CAM 依賴性激酶、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)等磷酸化，磷酸化的CREB可參與cAMP誘導的多種靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控;在神經(jīng)系統(tǒng)中，CREB可能介導神經(jīng)遞質(zhì)誘導的基因表達，并能通過放大神經(jīng)營養(yǎng)因子的信號，參與神經(jīng)細胞增殖分化、存活等生物效應(yīng)［9］。CREB還是一種調(diào)控可卡因獎賞作用的負性調(diào)控因子，其功能和表達的降低與可卡因獎賞效應(yīng)及戒斷后的抑郁癥狀密切相關(guān)［10］。大量研究證實，控制情緒反應(yīng)的中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)是與藥物成癮密切相關(guān)的獎賞系統(tǒng)中樞所在，而中腦腹側(cè)背蓋區(qū)(ventral tegmental area，VTA)和伏隔核(nucleus accumbens，NAc)更是關(guān)鍵區(qū)域。VTA的主要傳出纖維在NAc與中等大小棘突狀神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系，分2路投射至中腦黑質(zhì)網(wǎng)狀區(qū)和蒼白球(舊紋狀體)。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurophic factor，BDNF)與其受體酪氨酸激酶B(tyrosine kinase receptor B，TrKB)結(jié)合后［11］，激活 NAc 的有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路，進而促進CREB磷酸化。磷酸化的CREB一方面促進NAc內(nèi)強啡肽的分泌:強啡肽與VTA上κ-阿片受體結(jié)合后，負性調(diào)節(jié)VTA中多巴胺的運輸，使突觸間隙多巴胺減少，從而減弱可卡因產(chǎn)生的獎賞效應(yīng)［12］;另一方面，磷酸化的CREB誘導紋狀體中miR-212和miR-132過表達，過表達的miR-212反過來進一步放大CREB信號途徑，從而協(xié)同CREB發(fā)揮抗可卡因成癮作用［7］。

miR-212放大CREB信號途徑的主要機制有:(1)miR-212提高胞內(nèi)cAMP的水平，cAMP通過2條途徑放大CREB信號:包括a)G蛋白(guanylate binding protein，鳥苷酸結(jié)合蛋白)→腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，AC)→cAMP→PKA 途徑，即 cAMP-蛋白激酶途徑［13-14］，PKA被 cAMP激活后，催化 CREB 133位絲氨酸殘基磷酸化，從而激活CREB;b)CREB活性調(diào)控因子或CREB輔助因子(transducer of regulated CREB activity，TORC)途徑:雖然CREB能和靶基因結(jié)合并激活表達，但有時激活效應(yīng)活性較低;TORC是調(diào)節(jié)CREB活性的轉(zhuǎn)導蛋白，它能與CREB相互作用協(xié)調(diào)發(fā)揮激活效應(yīng)［15-16］。cAMP通過誘導TORC乙?；瘻p少TORC降解［17］，從而提高胞內(nèi)TORC，尤其是TORC2的水平，最終放大CREB/TORC級聯(lián)效應(yīng)。(2)miR-212激活Raf蛋白:Raf蛋白家族包括:Raf、B-Raf和 Raf-1［18］。一方面，活化的 Ras/raf蛋白激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)［19］，激活后的 ERK 通過磷酸化激活一系列細胞膜表面以及細胞質(zhì)、細胞核內(nèi)的類似核糖體S6蛋白激酶(ribosomalprotein S6 kinase，RSK)的蛋白激酶底物，并與之共同入核的方式促進CREB磷酸化;這就是Ras/Raf/MEK/ERK信號級聯(lián)通路，又稱ERK通路，是一條可被廣泛激活的MAPK通路［18-20］。另一方面，活化的Raf-1蛋白通過激活各亞型的AC，提高胞內(nèi)cAMP水平［21］，再經(jīng)cAMP-蛋白激酶途徑激活CREB。miR-212靶基因SPRED1是抑制Raf-1信號途徑的關(guān)鍵基因［22］，對ERK通路有一定的阻遏作用。miR-212下調(diào)SPRED1的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，從而解除其對ERK通路的抑制，見圖1。

Figure 1.miR-212 pathway in cocaine-induced synaptic plasticity.miR-212 is up-regulated in the dorsal striatum of rats with a history of extended access to cocaine.Striatal miR-212 decreases responsiveness to the motivational properties of cocaine by markedly amplifying the stimulatory effects of the drug on cAMP response element-binding protein(CREB)signalling.This action occurs through miR-212-enhanced Raf-1 activity，resulting in adenylyl cyclase sensitization and increased expression of cAMP and the essential CREB co-activator TORC.圖1 miR－212調(diào)控可卡因成癮途徑

2.2 miR-124與可卡因成癮 miR-124是腦組織中表達最為豐富的一類miRNA，約占腦組織miRNA總量的25%～48%。miR-124在分化神經(jīng)元和成熟神經(jīng)元中大量表達。將miR-124轉(zhuǎn)染到HeLa細胞中發(fā)現(xiàn)，HeLa細胞的基因組表達模式向神經(jīng)方向轉(zhuǎn)化，miR-124能使神經(jīng)細胞的特性得以獲得并維持［23］。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-124可以與超過1100個基因的基序相結(jié)合，并能抑制100多個基因的表達［23］，CREB和神經(jīng)元限制性沉默因子(RE1 silencing transcription factor，REST)就是其靶基因之一;miR-124與CREB、REST的3'UTR結(jié)合位點結(jié)合后，將抑制它們的翻譯過程從而減少兩者的表達。反復給予可卡因后，機體產(chǎn)生一種負反饋調(diào)節(jié)以對抗可卡因成癮，即神經(jīng)突觸釋放大量神經(jīng)遞質(zhì)如5-HT，5-HT經(jīng)ERK通路抑制miR-124的表達，進而促進CREB、REST以及BDNF等的表達［24］，并最終調(diào)控可卡因成癮的形成過程。

2.3 與可卡因成癮相關(guān)的其它miRNAs Chandrasekar等［24］運用逆轉(zhuǎn)錄定量 PCR(qRT-PCR)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)長時反復給予可卡因可誘導中腦邊緣多巴胺能神經(jīng)元miR-124和let-7d表達下調(diào)，而miR-181a表達上調(diào)，提示let-7d、miR-181a與miR-124一樣，參與可卡因成癮過程的調(diào)控。它們主要通過影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子［如CREB、轉(zhuǎn)錄阻遏子(transcriptional repressor)nucleus accumbens-1(NAC-1)、period2(Per2)蛋白、REST、BDNF、神經(jīng)遞質(zhì)受體(多巴胺受體、阿片類受體)以及信號蛋白MAPK4和磷脂酰肌醇4激酶2β(phosphatidylinositol 4-kinase type 2 beta，PI4K2β)］的表達水平，多途徑調(diào)控可卡因誘導產(chǎn)生的神經(jīng)可塑性改變，見圖2。Eipper-Mains等［25］發(fā)現(xiàn)腹側(cè)紋狀體中高表達的miRNAs，如miR-8家族，通過一些微調(diào)途徑如影響神經(jīng)遞質(zhì)的代謝和多肽類激素的分泌，可促進藥物如可卡因誘導的神經(jīng)可塑性改變。已知中腦邊緣多巴胺通路，尤其是腹側(cè)紋狀體的神經(jīng)可塑性改變是參與成癮藥物獎賞作用的重要神經(jīng)機制之一［26］;由此說明，miR-8家族也是調(diào)節(jié)可卡因成癮過程的miRNAs之一。

2.4 ADICD miRNAs 近年來，研究人員仍在不斷探索更多與可卡因成癮相關(guān)的miRNAs及其調(diào)控機制，為治療可卡因成癮提供新靶點。不久前，Schaefer等［27］發(fā)現(xiàn)給予野生型大鼠大劑量可卡因后，可誘導多巴胺受體2(dopamine receptor D2，Drd2)神經(jīng)元內(nèi)的63種miRNAs高表達，其中23種是argonaute 2(Ago2)依賴型miRNAs，又稱ADICD miRNAs;Ago基因編碼Ago 1、2、3和4蛋白，只有Ago2蛋白能夠抑制其靶基因ADICD miRNAs的表達［28］。高表達的 ADICD miRNAs在可卡因成癮形成過程中起促進作用，可能與其抑制抗可卡因成癮相關(guān)靶基因的表達有關(guān)。如:miR-18/23(CREB)、miR-3/23(Fos)、miR-6/2(FosB 3)、miR-3/23［細胞增強因子-2(myocyte enhancer factor 2，Mef2)］、miR-1/23(BDNF)以及 miR-369-3p(Mef2、FosB)［27］。但 ADICD miRNAs調(diào)控可卡因成癮形成的具體途徑和分子機制尚不清楚，有待進一步研究。

3 結(jié)語

Figure 2.miR-124，let-7d and miR-181a pathway in cocaine-induced synaptic plasticity.Several microRNAs affect the expression of many cocaine-regulated gene.The brain-enriched miR-124 is suppressed by chronic cocaine in the mesolimbic dopaminergic pathway(presumably by the induction of REST)，which induces expression of miR-124 target genes(BDNF，NAC-1，etc.)favoring the formation of addictive phenotype.Downregulation of let-7d results in induction of its target genes(DA-D3R).In contrast，miR-181a(also a brain-enriched miRNA)is markedly induced by cocaine，causing downregulation of its targets(PI4K2B，Per2 and RGS4).Study strongly supports the hypothesis that miR-124，let-7d and miR-181a are involved in a dynamic double-negative feedback loop，thereby regulating the differential expression of various genes in response to cocaine，which may result in the molecular adaptation leading to addiction.圖2 miR－124、let－7d和miR－181a調(diào)控可卡因成癮途徑

目前miRNAs調(diào)節(jié)可卡因成癮的作用還遠未被研究清楚，我們的認識可能只是冰山一角。到底有多少miRNAs參與了可卡因成癮的調(diào)控，其中又有哪些起促進作用，哪些起抑制作用，具體調(diào)控機制如何，這些問題還有待進一步深入研究。鑒定新miRNAs及其靶標在可卡因成癮患者體內(nèi)的表觀遺傳學改變，以及其生物功能和藥理學的利用價值等可能成為今后一段時間miRNAs治療藥物成癮研究的重要內(nèi)容。有人提出是否可以使用人工合成的miRNA寡核苷酸鏈(synthetic miRNA oligonucleotides)直接改變體內(nèi)的miRNA表達水平，從而作為新型治療工具在包括可卡因在內(nèi)的多種藥物成癮的治療中得到廣泛應(yīng)用?？傊?，對miRNAs更深入的研究可望有助于解決包括可卡因在內(nèi)的藥物成癮治療的難題。

［1］魏 聰，胡 兵，申 鍔.MicroRNAs在心臟發(fā)育和疾病中的作用［J］.中國病理生理雜志，2011，27(3):611-615.

［2］Bentwich I，Avniel A，Karov Y，et al.Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs［J］.Nat Genet，2005，37(7):766-770.

［3］Friedman RC，F(xiàn)arh KK，Burge CB，et al.Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs［J］.Genome Res，2009，19(1):92-105.

［4］Wu S，Huang S，Ding J，et al.Multiple microRNAs modulate p21Cip1/Waf1 expression by directly targeting its 3'untranslated region［J］.Oncogene，2010，29(15):2302-2308.

［5］胡 婷，鐘雪云.MicroRNA在腦膠質(zhì)瘤中的作用［J］.中國病理生理雜志，2011，27(7):1431-1437，1444.

［6］Tang Y，Banan A，F(xiàn)orsyth CB，et al.Effect of alcohol on miR-212 expression in intestinal epithelial cells and its potential role in alcoholic liver disease ［J］.Alcohol Clin Exp Res，2008，32(2):355-364.

［7］Hollander JA，Im HI，Amelio AL，et al.Striatal microRNA controls cocaine intake through CREB signaling ［J］.Nature，2010，466(7303):197-202.

［8］Baskerville S，Bartel DP.Microarray profiling of microRNAs reveals frequent coexpression with neighboring miRNAs and host genes［J］.RNA，2005，11(3):241-247.

［9］田今華，王曉民，韓濟生.cAMP反應(yīng)序列結(jié)合蛋白及其家族與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［J］.生理科學進展，1996，27(3):227-232.

［10］Renthal W，Kumar A，Xiao G，et al.Genome-wide analysis of chromatin regulation by cocaine reveals a role for sirtuins［J］.Neuron，2009，62(3):335-348.

［11］Bahi A，Boyer F，Chandrasekar V，et al.Role of accumbens BDNF and TrkB in cocaine-induced psychomotor sensitization，conditioned-place preference，and reinstatement in rats［J］.Psychopharmacology(Berl)，2008，199(2):169-182.

［12］Nair A，Vaidya VA.Cyclic AMP response element binding protein and brain-derived neurotrophic factor:molecules that modulate our mood?［J］.Biosci，2006，31(3):423-434.

［13］周愛儒，查錫良，于秉治，等.生物化學［M］.第6版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006.339-343.

［14］Fujita W，Takahashi M，Tokuyama S.The mechanism of the development of drug dependence［J］.Nippon Rinsho，2010，68(8):1445-1450.

［15］Zhou Y，Wu H，Li S，et al.Requirement of TORC1 for late-phase long-term potentiation in the hippocampus［J］.PLoS ONE，2006，1:e16.

［16］Li S，Zhang C，Takemori H，et al.TORC1 regulates activity-dependent CREB-target gene transcription and dendritic growth of developing cortical neurons［J］.J Neurosci，2009，29(8):2334-2343.

［17］Liu Y，Dentin R，Chen D，et al.A fasting inducible switch modulates gluconeogenesis via activator/coactivator exchange［J］.Nature，2008，456(7219):269-273.

［18］Dhillon AS，von Kriegsheim A，Grind lay J，et al.Phosphatase and feedback regulation of Raf-1 signaling［J］.Cell Cycle，2007，6(1):3-7.

［19］Hatzivassiliou G，Song K，Yen I，et al.RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth［J］.Nature，2010，464(7287):431-435.

［20］Thomas MJ，Kalivas PW，Shaham Y.Neuroplasticity in the mesolimbic dopamine system and cocaine addiction［J］.Br J Pharmacol，2008，154(2):327-342.

［21］Beazely MA，Alan JK，Watts VJ.Protein kinase C and epidermal growth factor stimulation of Raf1 potentiates adenylyl cyclase type 6 activation in intact cells［J］.Mol Pharmacol，2005，67(1):250-259.

［22］Brems H，Chmara M，Sahbatou M，et al.Germline loss-of-function mutations in SPRED1 cause a neurofibromatosis 1-like phenotype［J］.Nat Genet，2007，39(9):1120-1126.

［23］Lim LP，Lau NC，Garrett-Engele P，et al.Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs［J］.Nature，2005，433(7027):769-773.

［24］Chandrasekar V，Dreyer JL.microRNAs miR-124，let-7d and miR-181a regulate cocaine-induced plasticity［J］.Mol Cell Neurosci，2009，42(4):350-362.

［25］Eipper-Mains JE，Kiraly DD，Palakodeti D，et al.MicroRNA-Seq reveals cocaine-regulated expression of striatal microRNAs［J］.RNA，2011，17(8):1529-1543.

［26］Koob GF.Drugs of abuse:anatomy，pharmacology and function of reward pathways［J］.Trends Pharmacol Sci，1992，13(5):177-184.

［27］Schaefer A，Im HI，Ven? MT.Argonaute 2 in dopamine 2 receptor-expressing neurons regulates cocaine addiction［J］.Exp Med，2010，207(9):1843-1851.

［28］Carroll D，Mecklenbrauker I，Das PP.A Slicer-independent role for Argonaute 2 in hematopoiesis and the microRNA pathway［J］.Genes Dev，2007，21(16):1999-2004.