一氧化氮在休克大鼠離體淋巴管對(duì)P物質(zhì)反應(yīng)性中的作用*

司永華，牛春雨，秦立鵬，趙自剛，張 靜

(河北北方學(xué)院微循環(huán)研究所，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 張家口 075029)

淋巴循環(huán)是循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分，淋巴管收縮性是淋巴循環(huán)的動(dòng)力。整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，失血性休克(hemorrhagic shock，HS)早期淋巴管收縮性升高、后逐漸下降［1］，淋巴管收縮功能狀態(tài)與休克轉(zhuǎn)歸相關(guān)［2］;一氧化氮(nitric oxide，NO)的周期性變化參與了淋巴管生理狀態(tài)下的收縮、舒張以及張力調(diào)節(jié)［3－4］，且NO參與了休克離體淋巴管收縮性雙相變化的調(diào)節(jié)［5］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，休克2 h整體動(dòng)物與離體淋巴管對(duì)縮血管物質(zhì)去甲腎上腺素的反應(yīng)性均下降，其機(jī)制與鈣敏感性降低有關(guān)［6－7］;P物質(zhì)(substance P，SP)作為一種與淋巴組織感覺神經(jīng)支配有關(guān)的神經(jīng)肽，不僅對(duì)正常淋巴管平滑肌具有重要的正性肌力和變時(shí)性作用［8］，同時(shí)，還可增加休克各期離體淋巴管的泵功能［9］，休克離體淋巴管對(duì)SP的反應(yīng)性呈雙相變化。但NO是否參與了休克離體淋巴管反應(yīng)性的雙相變化?這也是針對(duì)淋巴管反應(yīng)性調(diào)控淋巴管收縮性的切入點(diǎn)之一，值得關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用離體淋巴管灌流技術(shù)，觀察NO/一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)工具藥對(duì)休克離體淋巴管反應(yīng)性的影響，探討NO在休克淋巴管反應(yīng)性中的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物與主要試劑 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠42只，體重250～300 g，購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;L－精氨酸(L－arginine，L－Arg)購于Sigma;1H －［1，2，4］惡二唑［4，3 －a］喹喔啉 －1 － 酮(1H －［1，2，4］oxadiazolo［4，3 － a］quinoxalin －1 －one，ODQ)購于Sigma;L－硝基－精氨酸甲酯(NG－nitro－L－arginine methyl ester，L－NAME)購于 Sigma;氨茶堿(aminophylline，AP)購于 Sigma;SP購于Alexis。

1.2 主要儀器 CH/2型微血管壓力－直徑測(cè)定儀(Living Systems Instrumentation，LSI);PS/20 型壓力伺服系統(tǒng)(LSI);TS100型倒置顯微鏡(Nikon);NE－1000型程控微量抽注泵(New Era Pump Systems Inc.);308/opt－o型視頻卡尺(Colorado Video Inc.);SSZ型手術(shù)顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠);RM6240BD型生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)。

2 方法

2.1 失血性休克模型的復(fù)制 大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)肌肉注射麻醉后，常規(guī)方法分離右側(cè)股靜脈和股動(dòng)脈，股靜脈注射肝素鈉(500 U/kg)全身抗凝，股動(dòng)脈插管并通過生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈血壓(mean artery pressure，MAP);同時(shí)，分離左側(cè)股動(dòng)脈，插管后連接注射器固定于抽注機(jī)上備放血用。待所有手術(shù)完成、穩(wěn)定30 min后，經(jīng)左股動(dòng)脈、應(yīng)用抽注機(jī)緩慢勻速放血，10 min內(nèi)將MAP降至40 mmHg，實(shí)驗(yàn)中通過調(diào)整放血量維持MAP在(40±2)mmHg水平，復(fù)制HS模型。其中，18只動(dòng)物在低血壓0.5 h制備離體淋巴管條，作為休克0.5 h組;18只動(dòng)物在低血壓2h制備離體淋巴管條，作為休克2 h組;其余6只動(dòng)物僅麻醉、手術(shù)，作為對(duì)照組(control)。

2.2 離體淋巴管條的制備、固定與穩(wěn)定 所有大鼠在相應(yīng)時(shí)點(diǎn)，腹腔注射大量戊巴比妥鈉(120 mg/kg)后，按我們方法［5，9］，取出胸導(dǎo)管，去除周圍組織，制備離體淋巴管條;將淋巴管條移入預(yù)先充有PSS緩沖液的微血管壓力－直徑測(cè)定儀的浴槽內(nèi)，將淋巴管兩端嵌套于浴槽內(nèi)2個(gè)直徑相匹配的毛細(xì)玻璃管(450～550 μm)，尼龍絲線結(jié)扎兩端固定，檢查胸導(dǎo)管壁有無滲漏、損傷和扭轉(zhuǎn);通過壓力伺服系統(tǒng)設(shè)置壓力為3 cmH2O，待其溫度自然升到室溫，然后再30 min將溫度逐漸加熱到37℃［10］。淋巴管出現(xiàn)自發(fā)性收縮后穩(wěn)定30 min(若無自發(fā)性收縮則棄去)，然后換1次液，以減少由于蒸發(fā)而引起的滲透壓變化［11］。

2.3 與NO工具藥共孵育 將出現(xiàn)自發(fā)性收縮的休克0.5 h淋巴管分別與L－Arg、L－Arg+ODQ孵育5 min(分別為休克0.5 h+L－Arg組、休克0.5 h+L－Arg+ODQ組);休克2 h淋巴管分別與 LNAME、L－NAME+AP孵育5 min(分別為休克2 h+L－NAME組、休克2 h+L－NAME+AP組)，均n=6。其中，L－Arg濃度為 1×10－3mol/L，ODQ、L－NAME和AP濃度均為1×10－5mol/L。

2.4 離體淋巴管收縮反應(yīng)性觀察 各組淋巴管在跨壁壓3 cmH2O下、穩(wěn)定10 min、出現(xiàn)穩(wěn)定的自發(fā)性收縮后，休克0.5 h、休克2 h各12根淋巴管條分別與NO工具藥孵育5 min后，記錄淋巴管的收縮頻率(contraction frequency，CF)、舒張末期口徑(end － diastolic diameters，EDD)和收縮末期口徑(end－systolic diameters，ESD)，待每條淋巴管收縮性觀察結(jié)束后，將其在無鈣PSS緩沖液中孵育15 min，測(cè)得淋巴管的最大被動(dòng)舒張口徑(passive diameters，PD)。結(jié)合文獻(xiàn)［3，10－11］，計(jì)算緊張性指數(shù)(tonic index，TI)、收縮幅度(contraction amplitude，CA)、泵流分?jǐn)?shù)(fractional pump flow，F(xiàn)PF)，其中:TI=(PD －EDD)/PD ×100%;CA=(EDD－ESD)/PD×100%;FPF=(EDD2－ ESD2)/EDD2× CF。以 CF、TI、CA 和 FPF作為淋巴管收縮性的指標(biāo)，以本次數(shù)據(jù)作為淋巴管收縮的基礎(chǔ)數(shù)值。隨后在各組淋巴管的浴槽中依次從低到高濃度加入SP母液，使浴槽中SP終濃度為10－8、3 ×10－8、10－7和 3 ×10－7μmol/L，在每次加入SP 1 min后，分別記錄 CF、SDD 和 ESD，計(jì)算 TI、CA和FPF等收縮性指標(biāo)。以在每一SP濃度下的CF、TI、CA和FPF與未加SP前淋巴管基礎(chǔ)值的差值ΔCF、ΔCA、ΔFPF 和 ΔTI，作為淋巴管對(duì) SP 反應(yīng)性的指標(biāo)，評(píng)價(jià)NO對(duì)休克淋巴管反應(yīng)性的作用。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊的資料多組間比較采用單因素方差分析，方差不齊的資料采用Kruskal－Wallis檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 NO對(duì)休克淋巴管ΔCF的影響

如圖1所示，休克0.5 h組淋巴管的ΔCF在SP濃度為 1×10－8mol/L、3×10－8mol/L 和 1 ×10－7mol/L時(shí)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，用L－Arg孵育后，ΔCF顯著降低(P＜0.05);與 L－Arg和ODQ同時(shí)孵育后，ΔCF升高至未加藥組水平，且在SP濃度為1×10－8mol/L和3×10－8mol/L時(shí)顯著高于對(duì)照組，在SP為1×10－8mol/L時(shí)顯著高于休克0.5 h+L－Arg組(P＜0.05，P＜0.01)。

休克2 h淋巴管ΔCF在SP濃度為3×10－7mol/L時(shí)低于對(duì)照組(P＜0.05);而用L－NAME孵育后，ΔCF顯著增高(SP濃度為3×10－7mol/L除外)，且在SP濃度為3×10－8mol/L時(shí)，顯著高于對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01);與 L－NAME和AP同時(shí)孵育后，在各濃度SP下，ΔCF呈下降趨勢(shì)，與未加藥組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在1×10－8mol/L和3×10－8mol/L時(shí)顯著低于休克2 h+L－NAME組(P＜0.05)。

Figure 1.Effects of ODQ and/or L －Arg，aminophylline(AP)and/or L －NAME on Δcontraction frequency of lymphatics after hemorrhagic shock.ΔContraction freguency:the maximal change in contraction freguency after the administration of SP..n=6.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs shock 0.5 h;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs shock 2 h;□P ＜0.05 vs shock 0.5 h+L－Arg;▲P＜0.05 vs shock 2 h+L－NAME.圖1 ODQ和/或L－Arg、AP和/或L－NAME對(duì)休克淋巴管ΔCF的影響

2 NO對(duì)休克淋巴管ΔTI的影響

由圖2可見，休克0.5 h組淋巴管的ΔTI在SP濃度為3×10－8mol/L時(shí)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);休克0.5 h組淋巴管與L－Arg孵育后，在SP為3×10－7mol/L和1×10－7mol/L時(shí)，ΔTI顯著降低(P＜0.05，P＜0.01);休克0.5 h組淋巴管與LArg和ODQ共孵育后，ΔTI呈上升趨勢(shì)，達(dá)對(duì)照組水平，且在SP濃度為1×10－7mol/L時(shí)顯著高于休克0.5 h+L－Arg組(P＜0.05)。

休克2 h組淋巴管的ΔTI在SP濃度為1×10－7mol/L時(shí)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05);與L－NAME孵育后，在不同濃度SP時(shí)，ΔTI出現(xiàn)增高趨勢(shì)，在1×10－8mol/L和3×10－8mol/L時(shí)顯著高于對(duì)照組與休克2 h組(P＜0.05，P＜0.01);休克2 h組淋巴管與L－NAME和AP共孵育后，ΔTI在SP為1×10－8mol/L和3×10－8mol/L時(shí)顯著低于休克2 h+LNAME 組(P＜0.05，P＜0.01)。

Figure 2.Effects of ODQ and/or L － Arg，aminophylline(AP)and/or L － NAME on Δtonic index of lymphatics after hemorrhagic shock.Δtonic index:the maximal change in tonic index after the administration of SP..n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs shock 0.5 h;△P＜0.01 vs shock 2 h;□P＜0.05 vs shock 0.5 h+L－Arg;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs shock 2 h+L－NAME.圖2 ODQ和/或L－Arg、AP和/或L－NAME對(duì)休克淋巴管ΔTI的影響

3 NO對(duì)休克淋巴管ΔCA的影響

圖3所示，各組淋巴管與不同物質(zhì)孵育，在梯度濃度的SP下，除休克0.5 h淋巴管的ΔCA在SP為3×10－8mol/L時(shí)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)外，其他均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Figure 3.Effects of ODQ and/or L－Arg，aminophylline and/or L －NAME on Δcontraction amplitude of lymphatics after hemorrhagic shock.ΔContraction amplitude:the maximal change in contraction amplitude after the administration of SP..n=6.*P ＜0.05 vs control.圖3 ODQ和/或L－Arg、AP和/或L－NAME對(duì)休克淋巴管ΔCA的影響

4 NO對(duì)休克淋巴管ΔFPF的影響

由圖4可見，休克0.5 h淋巴管在SP濃度為1×10－8mol/L和3×10－8mol/L時(shí)的ΔFPF均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01);與L－Arg孵育組在1×10－8mol/L、3×10－8mol/L和1×10－7mol/L時(shí)均顯著低于休克0.5 h組(P＜0.05)，與對(duì)照組無顯著差異;與L－Arg和ODQ共同孵育的休克0.5 h+LArg+ODQ組淋巴管的ΔFPF在SP濃度為1×10－8mol/L和3×10－8mol/L時(shí)顯著高于對(duì)照組與休克0.5 h+L－Arg組(P＜0.05，P＜0.01)。

休克2 h淋巴管的ΔFPF與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在SP濃度為1×10－8mol/L和3×10－8mol/L時(shí)，休克2 h淋巴管與 L－NAME孵育后，ΔFPF顯著增高(P＜0.01)，且在1×10－8mol/L時(shí)高于對(duì)照組(P＜0.05);休克2 h淋巴管與 LNAME和AP同時(shí)孵育，與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但SP在1×10－8mol/L和3×10－8mol/L時(shí)，顯著低于休克2 h+L－NAME組(P＜0.01)。

Figure 4.Effects of ODQ and/or L －Arg，aminophylline and/or L －NAME on Δfractional pump flow of lymphatics after hemorrhagic shock.ΔFractional pump flow:the maximal change in fractional pump flow after the administration of SP..n=6.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs shock 0.5 h;△△P ＜0.01 vs shock 2 h;□P ＜0.05 vs shock 0.5 h+L－Arg;▲▲P＜0.01 vs shock 2 h+L－NAME.圖4 ODQ和/或L－Arg、AP和/或L－NAME對(duì)休克淋巴管ΔFPF的影響

討 論

生理狀態(tài)下，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞僅表達(dá)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，在淋巴管收縮引起淋巴流的同時(shí)，產(chǎn)生剪切力，激活淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS，產(chǎn)生并釋放NO，瓣膜和管壁都會(huì)出現(xiàn)快速、短暫的NO增加，引起淋巴管舒張;隨著淋巴管舒張，NO含量減少，引起淋巴管下一步的收縮［12］。在淋巴管收縮過程中，NO幾乎隨收縮頻率的增快成比例增多;當(dāng)淋巴管收縮減弱時(shí)，NO開始減少［13］;可見，NO在正常淋巴管活動(dòng)的調(diào)節(jié)中具有重要作用。在炎癥、感染、休克、創(chuàng)傷等病理狀態(tài)下，受多種因素誘導(dǎo)，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)顯著增加［14］;淋巴管平滑肌細(xì)胞也可產(chǎn)生 iNOS［15］，引起NO升高。我室前期的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了NO與休克后期淋巴管的低收縮性有關(guān)。

為了進(jìn)一步證實(shí)NO在休克淋巴管反應(yīng)性中的作用，在前期工作基礎(chǔ)上，我們選擇了淋巴管反應(yīng)性雙相變化的2個(gè)關(guān)鍵時(shí)點(diǎn):休克0.5 h和休克2 h，制備離體淋巴管條，分別與NO供體L－Arg和NOS抑制劑L－NAME孵育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，L－Arg可顯著降低休克0.5 h淋巴管對(duì)多個(gè)SP濃度點(diǎn)的ΔCF、ΔTI與ΔFPF;L－NAME均可提高休克2 h淋巴管對(duì)多個(gè)SP濃度點(diǎn)的ΔCF、ΔTI與ΔFPF，且高于對(duì)照組水平。結(jié)果提示，NO/NOS途徑參與了休克后淋巴管反應(yīng)性的雙相調(diào)節(jié)。應(yīng)當(dāng)指出，L－Arg作為底物在NOS的作用下生成NO，該過程依賴于NOS活性［16］，為了觀察NO/NOS的作用，故本文在休克0.5 h采用了NO前體L－Arg，與休克2 h應(yīng)用NOS抑制劑L－NAME相對(duì)應(yīng)，而未應(yīng)用直接代謝即可生成NO的供體硝普鈉;當(dāng)然，硝普鈉在休克0.5 h時(shí)對(duì)淋巴管反應(yīng)性的作用還有待進(jìn)一步觀察。

研究表明，NO通過激活胞內(nèi)可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylate cyclase，sGC)，使三磷酸鳥苷環(huán)化產(chǎn)生環(huán)鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)，增高的cGMP激活cGMP依賴性蛋白激酶G，通過調(diào)節(jié)淋巴管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度、Ca2+敏感性，進(jìn)而調(diào)控淋巴管的收縮性［17］。為此，我們選擇了cGMP生成的關(guān)鍵酶sGC的抑制劑ODQ(減少cGMP生成)、磷酸二酯酶抑制劑AP(抑制cGMP裂解，增加cGMP濃度，提高胞內(nèi)Ca2+水平)作為調(diào)節(jié)cGMP水平的工具藥，分別與休克0.5 h+L－Arg、休克2 h+L－NAME孵育，觀察對(duì)淋巴管反應(yīng)性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在某些SP濃度點(diǎn)上，ODQ可顯著抑制L－Arg的作用，使ΔCF、ΔTI和ΔFPF顯著高于休克0.5 h+L－Arg組，ΔCF和 ΔFPF高于對(duì)照組水平;AP顯著抑制 L－NAME的作用，使 ΔCF、ΔTI與ΔFPF均明顯低于休克2 h+L－NAME組。結(jié)果提示，NO調(diào)節(jié)休克淋巴管反應(yīng)性雙相變化的機(jī)制可能是通過cGMP實(shí)現(xiàn)的。

應(yīng)當(dāng)指出，SP作用于淋巴管平滑肌細(xì)胞，通過Ca2+－鈣調(diào)蛋白－肌球蛋白輕鏈激酶通路，增加肌球蛋白輕鏈20磷酸化水平，使淋巴管收縮，調(diào)節(jié)生理與休克狀態(tài)下離體淋巴管的收縮功能［9，18］，故本文應(yīng)用SP作為評(píng)價(jià)淋巴管反應(yīng)性的工具藥，觀察NO/NOS的作用與機(jī)制;至于SP是否參與了NO的調(diào)節(jié)，還有待進(jìn)一步觀察。同時(shí)應(yīng)該看到，在SP濃度較高(尤其是3×10－7mol/L)時(shí)，各組間離體淋巴管反應(yīng)性多數(shù)未出現(xiàn)顯著差異，究其原因，可能為:淋巴管反應(yīng)性除與神經(jīng)、體液因子以及自身張力多種因素的調(diào)節(jié)有關(guān)外，還與淋巴管本身的結(jié)構(gòu)與物質(zhì)基礎(chǔ)相關(guān)，而過高濃度的SP可能掩蓋了休克淋巴管結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)對(duì)反應(yīng)性的影響。

綜上，本研究應(yīng)用離體淋巴管灌流技術(shù)，證實(shí)了NO參與了休克淋巴管反應(yīng)性的雙相調(diào)節(jié)，其作用機(jī)制可能與cGMP有關(guān);這對(duì)于以NO作為藥物靶點(diǎn)調(diào)控休克淋巴管的收縮性是一個(gè)有益的補(bǔ)充。

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