牛病毒性腹瀉弱毒疫苗免疫抗體水平與攻毒保護關(guān)系的研究

張淑琴 郭利 王煒 武華

中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，長春 130122

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）是黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus）的代表種，在分類上與豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）和邊界病毒（Border disease virus，BDV）同為一屬，抗原性有交叉性反應。病毒可感染牛、羊、豬等多種家畜和野生反芻動物，但以牛為主。受感染牛表現(xiàn)為發(fā)熱、白細胞減少、腹瀉、流產(chǎn)、黏膜糜爛潰瘍等急性感染癥狀及小牛先天持續(xù)性感染。1946年，Olafson等[1]首次在美國東北部地區(qū)發(fā)現(xiàn)并分離出BVDV。到目前為止，該病呈世界性分布，在大多數(shù)養(yǎng)牛國家都存在，給世界養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[2]。在我國，李佑民等[3]于1983年首次從國外引進牛的流產(chǎn)胎兒脾臟中分離并鑒定出BVDV，自此以來，我國新疆、內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅、青海、黑龍江、河南、河北、山東、遼寧、陜西、山西、廣西、四川、江蘇、安徽等20多個省市自治區(qū)均檢出此病，個別地區(qū)陽性率在85%以上[4]。

由于沒有很好的免疫防護措施，本病呈上升趨勢，對牛群的肥育、產(chǎn)奶和繁殖影響極大，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴重危害。疫苗接種是本病最主要的預防和控制措施，中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所自2006年就開始進行BVDV發(fā)病機理及疫苗研究，并成功分離到BVDV攻擊用強毒株[5]，正在進行牛病毒性腹瀉弱毒活疫苗的研究。本研究統(tǒng)計了進行牛病毒性腹瀉活疫苗研究過程中使用的部分試驗動物，確定血清中和試驗與攻毒試驗評價牛病毒性腹瀉弱毒活疫苗的保護效力的平行關(guān)系，為牛病毒性腹瀉病毒疫苗評價奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1）病毒和細胞。BVDV-SM疫苗株、BVDV-JL攻擊用強毒株和MDBK細胞，由中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所人獸共患病研究室保存。

2）主要試劑和儀器。DMEM培養(yǎng)基和馬血清，購自Hyclone公司；牛血清購自濟南勁牛公司科技有限公司；血細胞計數(shù)儀由SYSMIX公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1）試驗動物分組。試驗共使用3月齡以上健康易感斷乳牛125頭，免疫組70頭牛，對照組55頭牛。免疫組為頸部肌肉注射BVDV-SM株弱毒活疫苗；對照組為BVDV抗體陰性牛，頸部肌肉接種MDBK細胞凍融物。在免疫后最短28d后促凝采血，微量血清中和試驗檢測BVDV抗體效價。按中和抗體效價結(jié)果將所有試驗動物重新分組。第1組：1∶2＜SN≤1∶16，10 頭牛；第 2 組：1∶16＜SN≤1∶64，13 頭牛；第 3組：SN＞1∶128，47頭牛；第 4組為對照組，SN=1∶1，55頭牛。所有動物用BVDV-JL強毒株鼻內(nèi)噴霧接種攻擊，攻擊劑量為6×107.0TCID50/mL，攻毒后每日測量體溫，觀察記錄臨床癥狀并采集鼻拭子進行病毒分離，隔日采血用于病毒分離和白細胞計數(shù)，攻毒后14d結(jié)束（見表1）。

2）免疫接種及抗體檢測。制備的BVDV-SM弱毒活疫苗在冷凍條件下由實驗室運送到免疫現(xiàn)場，疫苗融解后頸部肌肉注射1mL/頭，所用的疫苗樣品立即低溫保存運回實驗室測定病毒毒價，回滴后確定免疫劑量。動物免疫后，每周采血分離血清，用于血清抗體檢測。并于28d后采血分離血清，檢測血清抗體效價。

3）攻毒。試驗牛使用BVDV-JL強毒（效價為107.0TCID50/mL）攻擊，攻擊劑量為6mL/頭，鼻內(nèi)噴霧接種，3mL/鼻孔。動物接種強毒后，同時每天觀察臨床癥狀，包括食欲、精神狀態(tài)等；每天測定體溫，表現(xiàn)。

4）病毒分離。動物接種強毒后，每日采集鼻拭子，隔日采血分離白細胞，用于病毒分離測定；試驗于病毒攻毒后14d結(jié)束。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體檢測結(jié)果

動物免疫后，體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗BVDV中和抗體?？贵w檢測結(jié)果顯示，免疫后14d內(nèi)開始產(chǎn)生抗體，通常28d后中和抗體效價介于210～211，抗體水平在2～3個月達到高峰，持續(xù)數(shù)周后緩慢下降，免疫12個月抗體水平仍在1∶724以上。

2.2 攻毒后臨床觀察結(jié)果

所有試驗動物經(jīng)BVDV-JL強毒株經(jīng)鼻內(nèi)噴霧攻毒后，對照牛（抗體陰性）的體溫超過基礎(chǔ)體溫1℃的有78%（43/55），白細胞數(shù)值下降，一般出現(xiàn)在第6天和第8天，93%（51/55）的牛白細胞下降比例超過30%。白細胞和鼻拭子病毒分離率為85%（47/55）。第 1 組 1∶2＜SN≤1∶16，有 70%（7/10）的牛體溫超過基礎(chǔ)體溫1℃，80%（8/10）的牛白細胞下降比例超過30%，70%（7/10）的牛在白細胞和鼻拭子中分離到病毒；第2組：1∶16＜SN≤1∶64，有46%（6/13）的牛體溫超過基礎(chǔ)體溫 1℃，62%（8/13）的牛白細胞下降比例超過30%，23%（3/13）的牛在白細胞和鼻拭子中分離到病毒；第3組：SN＞1∶128，有 4%（2/47）的牛體溫超過基礎(chǔ)體溫 1℃，2%（1/47）的牛白細胞下降比例超過30%，沒有牛（0/47）在白細胞和鼻拭子中分離到病毒。具體結(jié)果見表2。

表1 動物分組情況

表2 攻毒后體溫檢測及臨床觀察結(jié)果

3 討 論

弱毒疫苗是預防和控制BVD-MD的主要措施，第1株牛病毒性腹瀉弱毒疫苗研究始于1961年，是把致細胞病變型BVDV毒株Oregon C24V在原代牛腎細胞上連續(xù)傳代而被致弱[6]；1964年，弱毒疫苗開始大批量生產(chǎn)[7]，其用于預防牛病毒性腹瀉已有約50a的歷史。弱毒活疫苗既可刺激機體的細胞免疫，又可刺激機體產(chǎn)生體液免疫；動物免疫后產(chǎn)生免疫速度快并且免疫期持久，無需重復免疫。到目前為止，國外批準上市的抗BVDV的疫苗達數(shù)百種[8]。在集約化養(yǎng)牛業(yè)日益發(fā)達的今天，國外牛病毒性腹瀉疫苗成了養(yǎng)牛業(yè)必須使用的疫苗之一。我國目前尚無自主研發(fā)的牛病毒性腹瀉病毒活疫苗，此項研究可填補這一空白。本試驗將攻毒保護結(jié)果與攻毒時抗體效價結(jié)果平行比較分析，結(jié)果顯示，當BVDV抗體效價高于1∶128時，疫苗免疫可以對牛產(chǎn)生良好的保護效力，保護率在80%以上，牛病毒性腹瀉病毒活疫苗的抗體水平與保護效力之間存在一定的平行關(guān)系。進行牛病毒性腹瀉病毒活疫苗效力試驗必須使用本動物，沒有其他可供選擇的試驗系統(tǒng)。本研究采用血清學效力檢驗與靶動物免疫攻毒保護相關(guān)性的研究，探討一種更適于成品疫苗效力檢驗的評估方法，節(jié)約試驗成本，提高試驗效率，為牛病毒性腹瀉病毒活疫苗的效力檢驗研究提供依據(jù)。

[1]OLAFSON P，MACCALLUM A D，F(xiàn)OX F H.An apparently new transmissible disease of cattle[J].Cornell Vet，1946（36）：205-213.

[2]HOUE H.Epidemiological features and economical importance of bovine virus diarrhoea virus（BVDV） infections[J].Veterinary Microbiology，1999，64（2-3）：89-107.

[3]李佑民，劉振潤，武銀蓮.牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒株（長春184）的分離和鑒定[J].中國人民解放軍獸醫(yī)大學學報，1983，3（2）：113-121.

[4]張寧，秦建華.牛病毒性腹瀉-黏膜病的診斷與防治[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2008，27（2）：8-11.

[5]張淑琴，郭利，冷雪，等.牛病毒性腹瀉病毒BVDV-JL株的分離與鑒定[J].中國預防獸醫(yī)學報，2011，33（3）：181-184.

[6]COGGINS L，GILLESPIE J H，ROBSON D S，et al.Attenuation of virus diarrhea virus （strain Oregon C24V）for vaccine purposes[J].Cornell Vet，1961（54）：539-545.

[7]PETER C P，TYLER D E，RAMSEY F K.Characteristics of a condition following vaccination with bovine virus diarrhea vaccine[J].J Am Vet Med Assoc，1967（150）：46-52.

[8]GOYAL S M，RIDPATH J F.Bovine viral diarrhea virus：diagnosis，management and control[M].USA：Blackwell Publishing，2005：91-104.