丙泊酚注射液細菌內毒素檢查法研究

吳 志 張仁劍 閆 明 李永海

遼寧省人民醫(yī)院藥學部，遼寧 沈陽 110016

丙泊酚注射液為O/W型靜脈乳劑，屬于烷基酚類靜脈麻醉藥，具有作用時間短、麻醉誘導起效快、蘇醒迅速而完全、持續(xù)輸注后無蓄積、副作用少等特點[1-2]，臨床上廣泛用于全身麻醉的誘導、維持及ICU鎮(zhèn)靜[3]。目前法定的熱原檢查方法有家兔熱原檢查法和細菌內毒素檢查法。以前多用家兔法，但該法存在操作繁瑣、靈敏度低、重復性差、費時等缺點，而細菌內毒素檢查法操作簡單，靈敏度高，干擾少，速度快。可見用細菌內毒素檢查法替代家兔熱原檢查法是一種趨勢。筆者未檢索到有關丙泊酚注射液細菌內毒素檢查的報道，因此參照《中國藥典》2010年版二部附錄收載的“細菌內毒素檢查法”和相關文獻[4-10]，通過試驗研究，考察建立丙泊酚注射液細菌內毒素檢查法的可行性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

恒溫水?。ㄖ貞c試驗設備廠）、XW-80A旋渦混合器（上海醫(yī)大儀器廠），試驗所用玻璃器皿均在250℃烘烤2 h，以去除可能存在的外源性細菌內毒素。

1.2 試藥

鱟試劑（TAL，湛江博康海洋生物有限公司，0.1 mg/支，靈敏度0.25 EU/mL，批號：0702280；湛江安度斯生物有限公司，靈敏度0.25 EU/mL，批號：0807022）；細菌內毒素工作標準品（CSE，中國藥品生物制品檢定所，規(guī)格：160EU/支，批號：150601-200862）；細菌內毒素檢查用水（BET水，湛江博康海洋生物有限公司，2 mL/支，批號：090323）；丙泊酚注射液（商品名：得普利麻，規(guī)格：20 mL∶200mg，批號：GD280、GD953、GE746）。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核

根據(jù)鱟試劑標示靈敏度（λ）為0.25 EU/mL，用細菌內毒檢查用水溶解細菌內毒素工作標準品，在旋渦混合器上混勻15 min，然后制成 0.5000、0.2500、0.1250、0.0625 EU/mL 4個濃度的內毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30 s，取2個批號復溶后的0.1 mL/支的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.1 mL不同濃度的內毒素標準溶液，每個內毒素濃度平行做4管；另外2管加入0.1 mL細菌內毒素檢查用水作為陰性對照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入（37±1）℃的恒溫器中，保溫（60±2）min。對兩批鱟試劑進行靈敏度復核。見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復核結果

結果顯示，兩批鱟試劑經復核，靈敏度均在0.5λ～2.0λ之間，符合規(guī)定，可用于細菌內毒素檢查。

2.2 細菌內毒素限值（L）的確定

根據(jù)公式L=K／M確定供試品的細菌內毒素限值。其中，L為供試品的細菌內毒素限值，K為人每公斤體重每小時最大可接受的內毒素劑量，注射液的 K=5 EU／（kg·h），M 為人用每公斤體重每小時的最大供試品劑量。人均體重按60 kg計算。丙泊酚注射液在臨床上用于全麻維持時的用量最大，通常成人每小時9～15 mg/kg的給藥速率。則M=15 mg，L=0.33 EU/mg。但考慮到藥品使用安全性要求，將本品的細菌內毒素限值定為0.3 EU/mg。

2.3 最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定

根椐公式MVD=CL/λ計算。C為供試品溶液的濃度，為10 mg/mL，由“2.2”項下分析可知，L=0.3 EU/mg。 考慮到市售的鱟試劑靈敏度多在0.5000～0.1250 EU/mL之間，因此丙泊酚注射液的 MVD0.5000～0.0625為 6～24 倍。

2.4 干擾預試驗

取一批丙泊酚注射液做干擾預試驗。用細菌內毒素檢查用水將丙泊酚注射液進行逐級稀釋，制得原液、3、6、12、24倍的系列稀釋液，作為供試品陰性對照 （NPC）。另配制與NPC相同濃度梯度的供試品溶液，每個濃度添加等體積細菌內毒素工作標準品，制得每個濃度均含2λ細菌內毒素的系列溶液，作為供試品陽性對照（PPC）。每個濃度平行做兩管，同時作陽性對照（PC）、陰性對照（NC）。分別取2個廠家的，靈敏度0.25 EU/mL的鱟試劑進行試驗。見表2。

表2 丙泊酚注射液干擾預試驗結果

由表2結果可知，丙泊酚注射液稀釋12倍或以上倍數(shù)，可消除對細菌內毒素檢查的干擾。

2.5 干擾試驗

根據(jù)預試驗結果，選擇兩個廠家、λ為0.25 EU/mL的鱟試劑、丙泊酚注射液12倍稀釋液作為供試品溶液，進行干擾試驗。用供試品溶液及BET水分別將細菌內毒素工作標準品稀釋成含 2.00λ、1.00λ、0.50λ、0.25λ 的溶液，每一濃度平行做4管，另取BET水和供試品溶液分別作陰性對照、供試品陰性對照，各平行做兩管。按鱟試劑靈敏度度復核試驗項下操作。見表3。

表3 丙泊酚注射液干擾試驗結果

由表3的結果可知，用BET水和供試品溶液作陰性對照管、供試品陰性對照管，結果均為陰性，兩組鱟試劑的Es為 0.25 EU/mL， 在 0.5λ～2.0λ 之間；Et在 0.5Es～2.0Es之間（Es為BET水制成的內毒素標準溶液的反應終點濃度幾何平均值；Et為供試品溶液制成的內毒素標準溶液的反應終點濃度幾何平均值），試驗有效，說明丙泊酚注射液經12倍稀釋對鱟試劑與細菌內毒素之間凝集反應既無抑制作用，也無增強現(xiàn)象。

2.6 丙泊酚注射液細菌內毒素檢查

取3批丙泊酚注射液，使用λ=0.25 EU/mL的鱟試劑，參考《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪE依法檢查。見表4。

表4 丙泊酚注射液細菌內毒素檢查結果

由表4可知，NC和NPC均為陰性；PPC和PC均為陽性，試驗有效。結果表明，3批樣品的細菌內毒素檢查均符合規(guī)定。

3 討論

干擾預試驗是為了確定不出現(xiàn)干擾的第1個樣品稀釋度，初步選出對檢查無干擾的樣品稀釋倍數(shù)范圍及相應的鱟試劑靈敏度，減少后續(xù)試驗的盲目性。本試驗沒有選以市售鱟試劑靈敏度計算所得的MVD作為起始濃度，是為了更好地探索其干擾程度，故選用原液作為起始濃度。結果顯示，6倍稀釋液的供試品陽性對照均部分出現(xiàn)陽性，12倍稀釋液的供試品陽性均為陽性，因此，可確定不出現(xiàn)干擾的第1個樣品稀釋度為丙泊酚注射液的12倍稀釋液。

細菌內毒素檢查法具有操作簡單、迅速且靈敏度高的特點。但它的試驗結果會受到鱟試劑、生產工藝、處方配比、試驗環(huán)境或供試品稀釋方式等多種因素的影響而發(fā)生變化，不同廠家的相同品種對其細菌內毒素檢查所產生的干擾情況也存在較大的差別，因此，進行干擾試驗是很有必要的。

不同廠家的鱟試劑在生產工藝、抗干擾能力等方面存在差異。因此，本研究采用兩個不同廠家的、靈敏度0.25 EU/mL的鱟試劑，對3批丙泊酚注射液進行試驗。從干擾試驗可知，稀釋12倍的丙泊酚注射液溶液對細菌內毒素檢查沒有干擾，此方法是可行的。

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