乳酸基葛根素衍生物生物活性初步研究＊

陳立書 ，劉應(yīng)杰 ，曲中堂 ，譚 韜 ，張亞紅 ，侯長軍 ，蘭作平 ，3

(1.重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校，重慶 400030; 2.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400030;3.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016)

葛根素(puerarin)是從豆科植物中野葛 Pueraria lobata、甘葛藤 Pueraria thomsonii根中提取的一種黃酮苷，化學(xué)名為8－β－D－吡喃葡萄糖－4’，7－二羥基異黃酮，分子式是C21H20O9。動物試驗(yàn)及臨床研究表明，葛根素對心血管系統(tǒng)、平滑肌、機(jī)體體溫均有重要作用[1－7]，但其水溶性和脂溶性均較差，在水中的溶解度僅為4.6 g/L，故生物利用度較低，這就限制了其生物活性的發(fā)揮和臨床應(yīng)用。近年來，國內(nèi)外研究人員合成了葛根素的衍生物，以期改善葛根素的生物活性[8－14]。本研究中以葛根素為對照，對乳酸基葛根素衍生物進(jìn)行了生物活性初步研究[15]，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與材料、動物

RM6240B型生理記錄儀(成都儀器廠);血流變儀(濟(jì)南格利特科技有限公司);SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件。鹽酸普萘洛爾片(河南天方藥業(yè)股份有限公司，批號為100102);葛根素原料藥(成都雙流應(yīng)天化工廠，批號為100603，含量為99%);乳酸基葛根素衍生物(重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，批號為090116，經(jīng)高效液相色譜法測定含量均在95%以上);愈風(fēng)寧心片(北京同仁堂股份有限公司批號為100105)。

SD大鼠40只，SPF級，體重(200±10)g，雌雄各半;KM種小鼠80只，SPF級，雌雄各半，體重18～20 g(購買后在試驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)1周，以適應(yīng)環(huán)境)，兩種動物均由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號為 SCXY(渝)2007－0001，SYXK(渝)2007－0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

試驗(yàn)前，取葛根素原料藥，加滅菌蒸餾水配制成一定質(zhì)量濃度的葛根素溶液;取乳酸基葛根素衍生物，加滅菌蒸餾水配制成一定質(zhì)量濃度的葛根素衍生物溶液，備用;取鹽酸普萘洛爾片，碾細(xì)，加滅菌蒸餾水配制成一定質(zhì)量濃度的鹽酸普萘洛爾溶液，備用;取愈風(fēng)寧心片，研磨成粉末并加適量蒸餾水溶解過濾配制成一定質(zhì)量濃度的溶液，備用。

2.2 抗心肌缺血作用

選取SPF級SD大鼠40只，體重(200±10)g，雌雄各半，依體重和性別均分成4組，分別為正常動物組、愈風(fēng)寧心陽性對照組、葛根素溶液組和衍生物溶液組。正常動物組給予蒸餾水20 mL/kg灌胃，愈風(fēng)寧心陽性對照組每千克體重灌胃給予相當(dāng)于含10 mg葛根素的愈風(fēng)寧心溶液，葛根素溶液組每千克體重灌胃給予相當(dāng)于含400 mg葛根素的葛根素溶液，衍生物溶液組每千克體重灌胃給予相當(dāng)于含510 mg葛根素衍生物的溶液，連續(xù)給藥5 d。于第6天給藥1 h后，再用30%的戊巴比妥鈉按40 mg/kg腹腔注射麻醉后，連接Ⅱ?qū)?lián)電極，先描記各組正常心電圖，待穩(wěn)定后，于尾靜脈注入腦垂體后葉素(1 μg/kg)，立即記錄心電圖，連續(xù)描記34 min。計(jì)算給藥前后T波變化值，并對各組變化值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，在尾靜脈注射垂體后葉素 0.25，0.5，2，5 min 后，陽性對照組、葛根素溶液組、衍生物溶液組的T波幅度與正常動物組比較，均有顯著性差異(P＜0.05)。說明在本試驗(yàn)劑量下，葛根素、葛根素衍生物能明顯對抗垂體后葉素所致的大鼠心肌缺血，其中葛根素衍生物作用更顯著。

表1 抗垂體后葉素致大鼠心肌缺血T波變化試驗(yàn)結(jié)果(n=10)

2.3 抗心律失常作用

取KM種小鼠80只，按體重及性別隨機(jī)將其分成4組，每組20只，雌雄各半。正常動物組給予蒸餾水10 mL/kg灌胃，鹽酸普萘洛爾陽性對照組每千克體重給予含250 mg鹽酸普萘洛爾的溶液灌胃，葛根素組每千克體重給予相當(dāng)于含500 mg葛根素的葛根素溶液灌胃，衍生物組每千克體重給予相當(dāng)于含650 mg乳酸基葛根素的衍生物溶液灌胃。各組動物預(yù)先連續(xù)灌胃4 d，并于第5天灌胃1h后，將小鼠放入倒扣的含4mL氯仿棉球的500mL燒杯中，待小鼠呼吸停止后，立即打開胸腔檢查心室纖顫陽性率。結(jié)果正常動物組心室纖顫陽性17只(85.00%)，陽性對照組9只(45.00%)，葛根素組10只(50.00%)，衍生物組7只(35.00%)，顯示葛根素及其衍生物均能明顯對抗氯仿所致的小鼠心律失常，降低小鼠心室纖顫的發(fā)生率，其中以葛根素衍生物的作用更顯著(P ＜0.01)。

2.4 對高脂血癥大鼠血液流變學(xué)的影響

取SD大鼠40只，按體重及性別隨機(jī)分成5組，每組8只，雌雄各半?？瞻讓φ战M給予蒸餾水20 mL/kg灌胃，模型組給予蒸餾水20 mL/kg灌胃，愈風(fēng)寧心陽性對照組每千克體重給予含200 mg葛根素的愈風(fēng)寧心溶液灌胃，葛根素組每千克體重給予相當(dāng)于含400 mg葛根素的葛根素溶液灌胃，衍生物組每千克體重給予相當(dāng)于含510 mg乳酸基葛根素的溶液。各組動物連續(xù)灌胃5 d，除空白對照組外，其他組于第4天給藥1 h后，給予腎上腺素每100 g體重0.08 mL皮下注射。4 h后再注射1次，在兩次注射腎上腺素期間的中間時間點(diǎn)，將大鼠用冷水浸濕，在4℃冰箱中放置10 min，處置后禁食，次晨給藥1 h后取血檢測，分別考察全血高切黏度、全血低切黏度、血漿黏度等12項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果見表2，表明葛根素和衍生物均能顯著改善急性高脂血癥大鼠血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)，葛根素衍生物的作用更明顯(P＜0.05)。

表2 葛根素及衍生物對高脂血癥SD大鼠血液流變學(xué)的影響(n=8)

3 討論

國內(nèi)外大量的研究表明，葛根素具有多種藥理活性，且具有毒性小、代謝快的優(yōu)點(diǎn)。但其分子結(jié)構(gòu)屬于異黃酮類，使得葛根素的水溶性和脂溶性均較差，生物利用度不理想，制約了臨床應(yīng)用，因此必須對其加以結(jié)構(gòu)修飾。在目前報道的葛根素衍生物中，大部分的生物活性仍不理想，臨床應(yīng)用前景不被看好。

基于葛根素衍生物乳酸基葛根素的生物活性試驗(yàn)，本試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了其生物活性比葛根素有了一定程度的改善，達(dá)到了提高生物利用度、增強(qiáng)藥理活性的目的，同時本試驗(yàn)也為今后的制劑開發(fā)以及臨床應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持，提示該衍生物極具臨床藥用開發(fā)價值。

[1]Kinjo J，F(xiàn)urusawa J，Baha J，et al.Study on the constituents of Pueraria lobata.Ⅲ.Isoflavonoids and related compounds in the roots and the voluble stems[J].Chem Rham Bull，1987，35(12):4846－4850.

[2]Rong H，Stevens F，Deinzer L，et al.Identification of isoflavones in the roots of Pueraria lobata[J].Planta Medica，1998，64(7):620－627.

[3]楊志霞，李振彬，李 焱，等.葛根素的活血化瘀作用及其臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，16(19):2777－2778.

[4]張三印，沈映君，陳士林，等.葛根素誘導(dǎo)血管新生作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].陜西中醫(yī)，2007，28(10):1416 －1417.

[5]丁紅香，倪孔海，邵美娟，等.葛根素對創(chuàng)傷性休克兔心肌損傷的保護(hù)作用[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，17(3):145－147.

[6]范禮理，趙德化，趙敏崎，等.葛根黃酮抗心率失常作用[J].藥學(xué)學(xué)報，1985，20(9):647 －651.

[7]村岡健一，賀玉琢.葛根湯作用機(jī)制的研究:對犬體溫升高及免疫功能的影響[J].國外醫(yī)學(xué):中醫(yī)中藥分冊，2004，26(3):173.

[8]楊若林，李 娜，閔知大，等.葛根素衍生物的制備及其活性[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報，1999，30(2):81－85.

[9]侯殿杰，王建武，孫建龍.7，4’－二－氧－ (β－羥乙基)葛根素的制備研究[J].中國藥物化學(xué)雜志，2002，12(2):103 －104.

[10]Kozak，William GP，Puvin V，et al.Production of a product enriched in isoflavone values from natural sources:United States Patent，6517840[P].2003－02－11.

[11]王 靖.葛根素的結(jié)構(gòu)改造和藥理活性研究 [D].南京:中國藥科大學(xué)，2003.

[12]劉麗娟.葛根素衍生物的合成及藥效學(xué)研究[D].濟(jì)南:山東大學(xué)，2004.

[13]王 林，王升啟，李 魯，等.含水溶性基團(tuán)的葛根素化合物及其制法和用途:中國，CN1511840[P].2004－07 －14.

[14]Hendler，SheldonSZ，Jan.Isoflavonederivatives:UnitedStates，6541613[P].2003－04－01.

[15]霍丹群，侯長軍，舒 茂.乳酸基葛根素衍生物制備方法:中國，CN1970558[P].2007－05－30.