某地區(qū)不同采收期連翹葉中連翹酯苷、蘆丁和連翹苷的含量測定

王雨虹，賀愛玲

(1.中鐵十七局醫(yī)院，山西 太原 030032;2.山西中醫(yī)院，山西太原 030012)

連翹葉是木犀科植物連翹的干燥葉，主要含有連 翹苷、連翹酯苷、蘆丁、右旋松脂酚等化學(xué)成分［1］。有清熱解毒作用，主治心肺積熱;曾有研究顯示，連翹屬植物葉子與果實的成分有較好的一致性，葉子中有效成分如木質(zhì)素、咖啡堿和糖苷等的含量較果實中高。連翹葉在我國民間藥用己有較長歷史，我國河北、河南和陜西等地民間將連翹葉制作成保健茶飲用已有較長歷史，連翹葉具有十分廣泛的藥用價值。

為了確定連翹葉最佳的采收期，以連翹葉中含有的、已知具有較好生理活性的連翹酯苷、蘆丁和連翹苷3種物質(zhì)為指標(biāo)，測定了不同采收期的連翹葉中連翹酯苷、蘆丁和連翹苷的含量，期望對連翹葉資源的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

Waters515二元液相色譜泵;Waters2996型光電二極管陣列檢測器;萬分之一天平 FA/JA1004型;十萬分之一天平 METTLER TOLEDO AB135-S;KQ5200V型超聲波清洗機(jī)。

連翹葉(由中藥系鑒定教研組裴香萍老師鑒定)采自山西中醫(yī)學(xué)院校園，由于連翹先花后葉，所以在葉子生長茂盛的6月份開始采摘，采摘期至10月中旬。連翹苷(批號:110821-200610)、連翹酯苷對照品(批號:100080-200707)均購自中國藥品生物制品鑒定所;蘆丁對照品(經(jīng)高效液相檢測，純度大于98%)購自遼寧省生物醫(yī)藥研究所;實驗用水為雙蒸水(購自太原理工大學(xué)分析測試中心)和蒸餾水;甲醇為色譜純(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，甲醇為分析純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，0.45 μm微孔濾膜。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［2］

色譜柱:Alltima C18ODS(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇－水，梯度洗脫條件見表1;檢測波長280 nm;流速0.8 mL/min;柱溫為室溫。在上述色譜條件下對照品和供試品溶液各色譜峰的分離度良好，其他峰對連翹酯苷、蘆丁和連翹苷的含量測定無干擾。色譜圖見圖1。

表1 流動相梯度洗脫條件Table 1 The Condition of Elution of the Mobile Phase Gradient

圖1 HPLC色譜圖Fig 1 HPLC Chromatograms of Control Products and Samples(1.rutin;2.phillyrin;3.forsythiaside)

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品1.63 mg和連翹苷對照品2.93 mg置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得到儲備液。精密稱取連翹酯苷對照品2.94 mg，置于2 mL容量瓶中，用0.163 mg/mL的蘆丁對照品和0.293 mg/mL的連翹苷對照品混合溶液溶解并定容至刻度，搖勻。制成連翹酯苷濃度為1.47 mg/mL、蘆丁濃度為0.163 mg/mL、連翹苷濃度為0.293 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

將不同月份采集的連翹葉自然晾干，粉碎，得粗粉，稱取0.4 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中。精密加入50%甲醇20 mL，稱重，超聲提取30 min，放冷，用50%甲醇溶液補(bǔ)足重量，搖勻，上清液濾過，取續(xù)濾液即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取上述混合對照品溶液4.0 μL，6.0 μL，8.0 μL，10.0 μL，12.0 μL，14.0 μL，分別按照“2.1”項方法進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣量對峰面積作圖，計算回歸方程，結(jié)果表明連翹酯苷、蘆丁和連翹苷在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)果見表2。

表2 連翹酯苷、蘆丁和連翹苷在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系(n=6)Table 2 Linear Relation in Linear Range of Rutin，Phillyrin and Forsythiaside(n=6)

2.5 精密度試驗

精密吸取制備好的連翹酯苷、蘆丁、連翹苷混合對照品溶液10.0 μL，按照“2.1”項方法進(jìn)樣測定，分別重復(fù)進(jìn)樣6次，測得其峰面積，經(jīng)計算連翹酯苷、蘆丁、連翹苷峰面積的 RSD值分別為1.13%、1.07%、0.91%，表明儀器精密度良好。結(jié)果見表3。

表3 精密度測定結(jié)果(n=6)Table 3 Determination Results of Precision(n=6)

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取在室溫下放置的供試品溶液10.0 μL，按照“2.1”項方法分別測定，在0 h，3 h，6 h，9 h，12 h分別進(jìn)樣，記錄相應(yīng)保留時間峰的峰面積，計算連翹酯苷、蘆丁、連翹苷峰面積的 RSD值分別為0.99%、1.44%、1.25%，說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性測定結(jié)果(n=5)Table 4 Determination Results of Stability(n=5)

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批連翹葉藥材0.2 g，分取6份，精密稱定，按“2.3”項方法制備，按照“2.1”項的色譜條件分析測定，計算連翹酯苷、蘆丁、連翹苷重復(fù)性的RSD值分別為0.90%、0.46%、1.06%，說明該方法重復(fù)性良好。結(jié)果見表5。

表5 重復(fù)性測定結(jié)果(n=6)Table 5 Determination Results of Repeatability(n=6)

2.8 樣品中連翹酯苷、蘆丁、連翹苷的含量測定

取不同采收期的連翹葉1 g，精密稱定，按照“2.3”項方法制備樣品溶液，按“2.1”項的色譜條件測定樣品。結(jié)果見表6。

表6 不同采摘時期樣品中連翹酯苷、蘆丁、連翹苷的含量 mg/gTable 6 Contents of Rutin，Phillyrin and Forsythiaside in Samples Gathered in Different Periods mg/g

2.9 加樣回收率試驗

取同一批已知含量的連翹葉粉末6份各0.1 g，精密稱定，每份加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液按上述制備樣品的方法處理樣品，在上述色譜條件下分析測定。計算連翹酯苷、蘆丁、連翹苷的平均回收率為99.53%、98.92%、99.99%，RSD 值分別為0.79%、0.75%、2.91%。實驗結(jié)果表明，該方法有較好的準(zhǔn)確度?；厥章蕼y定結(jié)果見表7。

表7 回收率測定結(jié)果(n=6)Table 7 Determination Results of Recovery Rate(n=6)

3 討論

由本實驗結(jié)果可以看出，太原地區(qū)連翹葉中連翹酯苷、蘆丁和連翹苷在6月底和7月份含量最高，8、9、10月份含量逐漸下降，所以連翹葉的最佳采收期應(yīng)該以6月底和7月份為佳，這也說明民間采集幼嫩的連翹葉作為保健茶原料是有一定科學(xué)依據(jù)的。曾有人利用薄層掃描法對不同采收時期連翹葉中連翹苷的變化情況進(jìn)行過研究［3］，實驗結(jié)果顯示，連翹苷在5月份含量最高，隨生長期延長而逐漸降低，與本研究的實驗結(jié)果稍有不同，可能與材料來源不一致所導(dǎo)致有關(guān)。他們的實驗采集的連翹葉來源于不同的年份，樣品存儲時間不一致，本研究的材料均選用2008年樣品，可以保證結(jié)果的可信性。

連翹苷是2005版藥典規(guī)定的連翹藥材的質(zhì)控指標(biāo)之一，連翹酯苷是連翹具有抗病毒抗氧化作用的重要活性組分之一［4，5］，蘆丁具有抗氧化、降低毛細(xì)血管脆性與通透性等多種活性，所以選擇上述3種物質(zhì)作為指標(biāo)物質(zhì)可以較為全面的反映連翹葉的品質(zhì)。

連翹果實是我國傳統(tǒng)上最為常用的清熱解毒藥之一。有研究表明，連翹屬植物葉子與果實的成分有較好的一致性，而且葉子中的有效成分如木質(zhì)素、咖啡堿糖苷等的含量較果實中高［6］，所以對連翹葉資源的開發(fā)有較好的前景，同時對于連翹葉能否代替連翹果實入藥也是一個值得研究的課題。

本實驗采用HPLC法對不同采收期的連翹葉中連翹酯苷、蘆丁和連翹苷含量進(jìn)行測定及對比研究，結(jié)果表明不同時期采收的連翹葉中連翹酯苷、蘆丁和連翹苷的含量具有顯著差異，為確定連翹葉的合適采收期提供了依據(jù)，同時對增加連翹中連翹苷和連翹酯苷藥物的來源有一定的幫助。

［1］中華本草編輯委員會.中華本草［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999.

［2］Hui Guo，Ai Hualiu，Lie li，et al.Simultaneous Determination of 12 Major Constituents in Forsythia Suspensa by High Performance Liquid Chromatography-DAD Method［J］.Pharm Biomed Anal，2007，43(3):1000-1006.

［3］朱風(fēng)云，陳志紅，王 東，不同采收時間對連翹中連翹苷含量的影響［J］.河南中醫(yī)藥學(xué)刊，2002，43(3):1000-1006.

［4］胡克杰，徐凱建，王躍紅.連翹酯苷體外抗病毒作用的試驗［J］.中國中藥藥科技，2001，8(2):89.

［5］張立偉，趙春貴，楊 頻.連翹酯苷抗氧化活性及構(gòu)效關(guān)系研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2003，38(5):334-336.

［6］丁 岡，劉延澤.中藥連翹及其同屬植物的研究近況［J］.中藥材，1994，17(10):42-44.