重組降血壓肽緩釋微球?qū)ψ园l(fā)性高血壓大鼠的降壓作用

孫海燕，羅菊珍，劉 冬

(深圳職業(yè)技術(shù)學院，廣東 深圳 518055)

前文制備了重組降血壓肽(rAHP，序列為VLPVPR)聚乳酸(rAHP-PLA)緩釋微球，并進行了體外釋藥試驗［1］，本文選用自發(fā)高血壓大鼠(SHR)為實驗動物模型，研究了該緩釋微球經(jīng)口服和皮下注射兩種給藥方式對大鼠血壓的影響。

1 材料

rAHP-PLA 緩釋微球，自制［1］;rAHP 標準品(序列為VLPVPR，純度≥99%)，本實驗室通過基因工程方法制得。

RM6240BD多道生理信號采集處理系統(tǒng)，成都儀器廠。

SHR和同源正常血壓(WKY)大鼠，雄性，12周齡，體質(zhì)量250～300 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號:SGXK(滬)200920010。

2 方法

SHR和WKY大鼠單籠喂養(yǎng)，自由進水，保持環(huán)境溫度(24±1)℃，相對濕度(60±5)%，光照和黑暗各12 h。大鼠適應(yīng)環(huán)境7 d后，分別測其體質(zhì)量和血壓。SHR收縮壓＞180 mmHg、WKY收縮壓＜140 mmHg用于實驗。符合實驗要求的SHR按體質(zhì)量和血壓均衡隨機分組，每組8只。

實驗分為口服給藥和皮下注射兩種給藥方式。對于口服給藥，SHR分為空白組、原藥組和微球高、中、低劑量組，分別一次灌胃生理鹽水、rAHP 800 μg/kg，rAHP緩釋微球高、中、低劑量(800，400 和200 μg/kg);對于皮下注射給藥，SHR分為空白組、原藥組和微球高、中、低劑量組，分別一次性皮下注射生理鹽水、rAHP 800 μg/kg，rAHP緩釋微球高、中、低劑量(800，400 和 200 μg/kg);對于 WKY 大鼠，則分為口服空白組、皮下注射空白組、口服微球組、皮下注射微球組共4組，分別一次性口服或皮下注射生理鹽水、口服微球(800 μg/kg)、皮下注射微球(800 μg/kg)。分別測定各組大鼠給藥前后不同時間點的尾動脈收縮壓變化情況［2-3］。

應(yīng)用SPSS1110統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，采用重復測量的方差分析比較各組間給藥前后的血壓變化，組內(nèi)給藥前后的血壓變化采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 口服rAHP-PLA緩釋微球?qū)HR大鼠的降壓作用

大鼠給藥后不同時間的尾動脈收縮壓變化見圖1。

采用重復測量的方差分析結(jié)果表明，原藥組和微球組給藥前后不同時間大鼠的動脈血壓間存在差異(P＜0.01)，同時段各給藥組間的血壓變化也存在差異(P＜0.01)。微球組給藥后血壓的變化趨勢相同，給藥后不同時間與給藥劑量間無交互作用(P＞0.05)。

分別進行分組因素單獨效應(yīng)分析和時間因素單獨效應(yīng)分析表明，與空白對照組相比，原藥組灌胃給予rAHP原藥800 μg/kg 2 h后，SHR血壓降至最低點(152.5 ±7.9)mmHg，此后血壓逐步回升，給藥后8 h，血壓回升至(189.9 ± 8.4)mmHg，和空白組相比無顯著性差異。微球中劑量和高劑量組給藥10 h后，SHR血壓均降至最低點，分別為(173.9±8.9)和(161.5 ±10.6)mmHg。此后血壓逐步回升，在給藥后 36 h，血壓分別回升至(189.4 ±6.8)和(181.2±8.3)mmHg，和空白組相比仍有顯著性差異(P＜0.05)。微球低劑量組給藥后，血壓呈現(xiàn)一定的下降趨勢，但和空白組相比無顯著性差異。

以上分析結(jié)果表明，與空白對照組相比，口服給予rAHP-PLA緩釋微球中劑量和高劑量4 h后，開始具有降壓作用(P＜0.01)，之后隨著給藥時間的延長降壓作用趨于明顯，給藥后10 h血壓降至最低點，至給藥后36 h，依然有降壓作用。與灌胃給予rAHP原藥2 h后降壓效果最強且藥效持續(xù)6 h相比，rAHP-PLA緩釋微球顯著延長了rAHP的作用時間。

圖1 單次口服rAHP-PLA緩釋微球后SHR大鼠血壓變化Fig.1 Changes of SBP after single oral administration of rAHPPLA microsphere

3.2 皮下注射rAHP-PLA緩釋微球?qū)HR大鼠的降壓作用

大鼠給藥后0～9 d內(nèi)不同時間的尾動脈收縮壓變化見圖2。

采用重復測量的方差分析結(jié)果表明，原藥組和微球組給藥前后不同時間大鼠的動脈血壓間存在差異(P＜0.01)，同時段各給藥組間的血壓變化也存在差異(P＜0.01)。微球組給藥后血壓的變化趨勢相同，給藥后不同時間與給藥劑量間無交互作用(P＞0.05)。

分別進行分組因素單獨效應(yīng)分析和時間因素單獨效應(yīng)分析表明，與空白對照組相比，原藥組皮下注射rAHP原藥800 μg/kg 4 h后，SHR血壓降至最低點(157.5 ±8.4)mmHg，此后血壓逐步回升，給藥后48 h，血壓回升至(186.7 ±8.5)mmHg，和空白組相比仍有顯著性差異(P＜0.01)。微球中劑量和高劑量組給藥30 h后，SHR血壓均降至最低點，分別為(173.9 ±6.0)和(158.8 ±8.9)mmHg。此后血壓逐步回升，在給藥后216 h(9 d)，微球中劑量組血壓回升至(198.6±6.9)mmHg，給藥后 240 h(10 d)，微球高劑量血壓回升至(197.2 ±9.2)mmHg，和空白組相比無顯著性差異(P＞0.05)。微球低劑量組皮下注射給藥后，血壓呈現(xiàn)一定的下降趨勢，但和空白組相比無顯著性差異。

由圖2可以看出，皮下注射rAHP標準品4 h后，SHR大鼠的血壓出現(xiàn)最低值，藥效持續(xù)48 h，說明皮下注射rAHP在體內(nèi)迅速起效，之后隨著rAHP的逐漸吸收，藥效進一步持續(xù)，但48 h后體內(nèi)藥物濃度減少，藥效逐漸消失。皮下注射rAHP-PLA緩釋微球中劑量和高劑量6 h后開始具有降壓作用(P＜0.05)，之后隨著給藥時間的延長降壓作用趨于明顯，給藥后20 h時血壓降至最低點，藥效一直分別持續(xù)至給藥后第9天和第10天，表明與rAHP原藥相比，rAHP-PLA緩釋微球顯著延長了作用時間，具有明顯的緩釋效果。

圖2 單次皮下注射rAHP-PLA緩釋微球后SHR大鼠的血壓變化Fig.2 Changes of SBP after single dose subcutaneous injection of rAHP-PLA microsphere

3.3 rAHP-PLA緩釋微球?qū)KY大鼠血壓的影響

結(jié)果見圖3～4?？梢?，單次灌胃及單次皮下注射給予rAHP-PLA緩釋微球后，WKY大鼠的血壓變化與空白對照組相比基本相同，兩者無顯著性差異(P＞0.05)，表明rAHP-PLA緩釋微球?qū)φ４笫笱獕簾o影響。

4 討論

圖3 單次口服給予rAHP-PLA微球后WKY大鼠血壓變化Fig.3 Changes of SBP after single oral administration of rAHPPLA microsphere

圖4 單次皮下注射rAHP-PLA微球后WKY大鼠血壓變化Fig.4 Changes of SBP after single dose subcutaneous injection of rAHP-PLA microsphere

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，蛋白多肽類藥物已逐漸在疾病預防及治療方面發(fā)揮著越來越重要的作用。但與小分子藥物相比，此類藥物普遍具有穩(wěn)定性差、生物利用度低、體內(nèi)生物半衰期短、極易被生物體內(nèi)的酶分解等缺點，使它們在治療領(lǐng)域的應(yīng)用受到很大限制。因此，蛋白及多肽類藥物的給藥系統(tǒng)已成為現(xiàn)代藥劑學研究的熱點。目前，可生物降解微球系統(tǒng)被認為是蛋白多肽類藥物劑型的改進方向，如注射用緩釋制劑，口服及鼻腔吸入劑等。臨床研究證明，微球系統(tǒng)不僅能有效防止藥物在體內(nèi)的快速降解，還可以靶向送達體內(nèi)有效部位，達到緩釋目的。本實驗室在利用基因工程方法成功進行了rAHP高效表達的基礎(chǔ)上，利用生物可降解材料制備得到了rAHP-PLA緩釋微球，體外釋放實驗表明，該微球在pH為7.4的磷酸緩沖液中具有較好的緩釋效果［4］。

本文在前期研究的基礎(chǔ)上，研究了口服和皮下注射兩種給藥方式下rAHP-PLA緩釋微球?qū)HR大鼠的降壓作用。實驗結(jié)果表明，口服rAHP-PLA緩釋微球中劑量和高劑量(800和400 μg/kg)后4 h大鼠血壓明顯降低，至給藥后10 h藥效達到最高，且可以持續(xù)36 h。皮下注射rAHP-PLA緩釋微球中劑量和高劑量(800和400 μg/kg)后6 h大鼠血壓明顯降低，至給藥后20 h藥效達到最高，且可以持續(xù)近216 h(9 d)。與單次口服和皮下注射rAHP 800 μg/kg的降壓效果相比，可以明顯延長作用時間，具有顯著的緩釋效果。實驗結(jié)果還表明，單次口服和皮下注射rAHP-PLA緩釋微球?qū)KY大鼠的血壓沒有影響。

微球給藥系統(tǒng)是蛋白多肽類藥物傳輸系統(tǒng)的一個重要的研究方向［5-7］。利用生物可降解聚合物PLA作為骨架材料制備的微球給藥系統(tǒng)，能夠調(diào)節(jié)rAHP的釋放速度，且微球的空間位阻能夠防止胃腸道中酶類與降血壓肽的接觸，從而保持了多肽藥物的穩(wěn)定性。有利于促進降血壓肽的吸收，提高生物利用度，達到緩釋的作用。隨著生物和制劑技術(shù)的發(fā)展以及對微球制劑研究的不斷深入，多肽及蛋白類藥物的臨床應(yīng)用前景也必將越來越廣闊。

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