多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶抑制劑對順鉑在肺癌治療中增敏的作用研究

戎建輝，應(yīng)景艷

(浙江省寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院，浙江 寧波 315100)

原發(fā)性支氣管肺癌是目前人類最常見的惡性腫瘤之一，近20年來其發(fā)病率和病死率的上升幅度在全部惡性腫瘤中位居首位。2003年世界衛(wèi)生組織(WHO)公布全球肺癌發(fā)病率是120萬/年，死亡率是110萬/年，我國城市肺癌發(fā)病率位居常見惡性腫瘤的首位，預(yù)計到2015年，我國將成為肺癌高發(fā)國［1］。目前對肺癌的治療主要是手術(shù)治療為主，聯(lián)合放療和化療等綜合治療，但是近年來肺癌5年生存率仍低于10%，其中化療耐藥成為制約肺癌治療效果的主要原因。順鉑是一類細胞周期非特異性化療藥物，能與腫瘤細胞的DNA結(jié)合，抑制其DNA的損傷修復(fù)及復(fù)制過程，從而抑制腫瘤細胞增殖，被廣泛應(yīng)用于肺癌的臨床治療［2］。如何增加肺癌細胞對順鉑的敏感性，成為近年來藥理學(xué)與腫瘤學(xué)的研究熱點。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶［poly adenosine diphoshate(ADP)-ribose polymerase-1，PARP-1］是存在于真核細胞中催化聚ADP核糖化的細胞核酶，其參與的聚ADP核糖化是真核細胞中蛋白質(zhì)翻譯后的重要修飾方法之一。PARP-1在DNA修復(fù)、細胞凋亡和腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［3］。體內(nèi)外研究表明，抑制PARP-1可降低DNA修復(fù)功能，增強放化療對多種腫瘤的治療效果［4］，但目前關(guān)于PARP-1抑制劑對順鉑在肺癌治療中增敏作用的研究較少。本研究以肺腺癌細胞系A(chǔ)549細胞為研究對象，從細胞增殖抑制，DNA、染色體損傷等方面探討經(jīng)典的PARP-1抑制劑4-氨基-1，8-萘二胺(4-Amino-1，8-Naphthalimide，4-AN)對順鉑的增敏作用及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

4-AN(純度為99%)，美國Sigma公司;順鉑，齊魯制藥廠;四甲基偶氮唑鹽(MTT)，F(xiàn)luka公司;溴化乙啶(EB)，Amresco公司;DMEM培養(yǎng)基和新生牛血清，Gibco公司。

倒置熒光顯微鏡，Leica;顯微數(shù)碼攝像圖像采集系統(tǒng)，Pixera;DYY-6C型電泳儀和DYCP-34A型電泳槽，北京六一儀器廠;酶標儀(Microplate Reader)，Bio-Rad。

1.2 細胞培養(yǎng)

A549細胞購于上海研晶生物科技有限公司，接種于含10%新生牛血清及100 μg/mL青霉素、鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d傳代1次。

1.3 MTT法檢測4-AN與順鉑聯(lián)合作用對A549細胞的生長抑制效應(yīng)

取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的A549細胞以200個/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，隨機分為對照組與順鉑處理組，分別以含終濃度為0和5 μg/mL順鉑以及不同濃度 4-AN(0，1，2，3，5，10，20，30，50 μmol/L)的DMEM液培養(yǎng)，每個樣本設(shè)8個平行孔。24 h后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞3次，加入0.5 mg/mL MTT 溶液 100 μL/孔，37 ℃培養(yǎng) 4 h，棄去含MTT的培養(yǎng)液，PBS洗滌細胞1次，每孔加入二甲亞砜(DMSO)150 μL，振蕩2 min直到藍色結(jié)晶完全溶解。用酶標儀在570 nm波長處測吸光度值(A)值。以4-AN濃度為橫坐標，A值為縱坐標，繪制存活率曲線。

1.4 克隆形成實驗

將對數(shù)生長期的A549細胞以2×105個/mL濃度接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，隨機分為對照組與順鉑處理組，以含終濃度為0和5 μg/mL順鉑及不同濃度4-AN的DMEM液培養(yǎng)。24 h后，用0.25%胰蛋白酶收獲細胞并制成細胞懸液，以200個/孔的濃度接種于24孔板，每個樣本接種3個復(fù)孔，待細胞貼壁后，更換新鮮的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)10 d，以PBS(pH 7.4)洗滌細胞 3 次，甲醇固定 20 min，10%Giemsa染色15 min，水沖洗，自然風(fēng)干，于解剖顯微鏡下計數(shù)每孔中克隆數(shù)(含50個細胞以上的為1個克隆)，每孔計數(shù)2次，計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?(各試驗組平均克隆形成數(shù)/接種細胞總數(shù))×100%。

1.5 單細胞凝膠電泳

對數(shù)生長期的A549細胞用不同濃度的4-AN(0，10，30 μmol/L)及終濃度為 0 和 5 μg/mL 順鉑處理24 h，以0.25%胰酶消化并制成(105～106)/mL的細胞懸液，分別取細胞懸液1 mL于1.5 mL離心管中，3 000 r/min離心5 min，棄上清;收獲細胞并用PBS洗滌細胞3次，用37℃熔化的0.65%低熔點瓊脂糖900 μL吹打成細胞懸液，裂解、解旋、電泳、中和;然后用20 μg/mL EB染色。染色后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，以拖尾率(comet rate，每張片子隨機數(shù)200個細胞，計數(shù)其中彗星細胞的數(shù)目，算出拖尾細胞百分率)和Olive尾距(Olive Tail Moment，OTM)作為分析指標進行統(tǒng)計學(xué)分析，OTM=尾部DNA含量×頭部中心到尾部中心的距離。

1.6 體外微核試驗檢測MMS誘導(dǎo)的染色體斷裂

將細胞接種于6孔板中，每孔1 mL培養(yǎng)液中含細胞1×106個，37℃培養(yǎng)。當細胞長到對數(shù)生長期時，每孔加入不同濃度的 4-AN(0，10，30 μmol/L)以及終濃度為0和5 μg/mL順鉑的 DMEM液，37℃作用24 h后棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌后收獲細胞，1 000 r/min 離心5 min，加入 0.075 mol/L KCl溶液2.5 mL，靜置 5 min，以體積比為 3∶1 的甲醇冰醋酸反復(fù)固定細胞后制成細胞懸液0.5 mL，用吖啶橙染色，立即在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。進行微核試驗，計算微核細胞率。微核細胞率(%)=(微核細胞數(shù)/觀察細胞總數(shù))×100%。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)用(x±s)表示，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料采用單因素方差分析，微核細胞率采用Possion分布的u檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1 4-AN增強順鉑對A549細胞的殺傷作用

不同劑量4-AN與順鉑作用后，A549細胞的生長抑制情況見圖1，在相同濃度順鉑作用下，A549細胞存活率隨著4-AN濃度的增加而減少，呈明顯劑量反應(yīng)關(guān)系。在順鉑劑量為5 μg/mL的實驗組中，當4-AN藥物濃度在1～10 μmol/L時，A-549細胞存活率在76% ～92%之間，而當4-AN藥物濃度大于10 μmol/L時，A549細胞存活率急劇降低，表明4-AN可以劑量依賴的增加順鉑對A-549細胞的生長抑制作用。

圖1 4-AN對順鉑抑制A549細胞存活率的影響

2.2 克隆形成試驗結(jié)果

順鉑與不同濃度4-AN聯(lián)合處理的A549細胞克隆形成率見表1。結(jié)果顯示，在相同劑量順鉑作用下，A549細胞克隆形成率均隨4-AN濃度的增加而降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。說明在所有試驗設(shè)計濃度，4-AN可增強順鉑對肺腺癌細胞的克隆抑制能力。

2.3 4-AN與順鉑聯(lián)合作用對A549細胞的DNA損傷效應(yīng)

表1 4-AN與順鉑作用后A549細胞的克隆形成率

DNA損傷效應(yīng)用單細胞凝膠電泳檢測，彗星圖見圖2，數(shù)據(jù)見表2。無藥物處理組細胞核基本呈規(guī)則的原型，較大，亮度較高且均勻，較少出現(xiàn)拖尾，且尾部DNA含量很少。順鉑組與順鉑聯(lián)合4-AN組則出現(xiàn)拖尾，且后者彗星細胞率及尾部DNA含量均顯著高于前者(P＜0.05)，表明4-AN能增加順鉑造成的DNA損傷。

圖2 4-AN與順鉑聯(lián)合作用對A549細胞DNA損傷的彗星圖(200×)

表2 4-AN與順鉑聯(lián)合作用對A-549細胞的DNA損傷效應(yīng)

2.4 4-AN與順鉑聯(lián)合作用對A549細胞的染色體損傷作用

4-AN與順鉑聯(lián)用導(dǎo)致的A549染色體損傷用微核試驗進行檢測，結(jié)果見表3。順鉑組與順鉑聯(lián)合4-AN組的微核細胞率均高于無藥物處理組(P＜0.05)。在相同順鉑劑量下，微核細胞率與4-AN濃度呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系。表明4-AN能增加順鉑造成的染色體損傷，從而增加肺腺癌細胞對順鉑的敏感性。

表3 4-AN與順鉑聯(lián)合作用對A-549細胞的染色體損傷效應(yīng)

3 討論

目前肺癌治療的手段為手術(shù)、化療和放療的綜合療法，而我國80%的肺癌患者在臨床確診時已經(jīng)失去手術(shù)機會，代之以化療作為主要的治療手段。順鉑作為一線的肺癌化療藥物，其臨床地位不可替代，但因其耐藥性日益嚴重。尋求高效低毒的順鉑增敏劑，以提高其化療效果，是藥理學(xué)和腫瘤學(xué)研究的重要內(nèi)容。由于順鉑是一類以腫瘤細胞DNA為靶點的的化療藥物，因此，針對參與DNA損傷識別，反應(yīng)和修復(fù)的分子靶向探索是目前順鉑增敏的主要研究方向。

PARP-1在DNA損傷修復(fù)，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的調(diào)節(jié)與細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，其表達的異?？赡軘_亂正常的DNA修復(fù)功能，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明淋巴瘤細胞中的PARP-1基因表達較正常淋巴細胞增強，且肝癌細胞中PARP-1活性增加且與癌細胞分化程度相關(guān)［5］，而抑制PARP-1則可降低DNA修復(fù)功能，增強化療對腫瘤的治療效果［4］。4-AN是一類新型的PARP-1抑制劑，已有實驗證實具有放射增敏作用［6］。本研究以人肺腺癌細胞A549細胞為研究對象，從癌細胞生長抑制，DNA、染色體損傷等方面，探討4-AN對順鉑在治療肺腺癌細胞中的增敏作用和相關(guān)機制研究。

常用的測定體外培養(yǎng)細胞化療增敏性的實驗分為細胞毒性試驗和遺傳毒性試驗兩類。細胞毒性試驗主要有人工血球計數(shù)法、臺盼藍計數(shù)法、3H-TDR參入法、羅丹染色法和MTT比色法和克隆形成實驗等［7］。腫瘤細胞的特征是具有自我更新和增殖能力，可分化和形成克隆，相對克隆形成率和克隆形成抑制率是判斷外源性化合物細胞毒性效應(yīng)的金標準，因此，克隆形成試驗也被廣泛應(yīng)用于化療藥物敏感性的測定。本研究采用MTT法和克隆形成試驗檢測4-AN與順鉑聯(lián)合作用對A549細胞的細胞毒性效應(yīng)。結(jié)果顯示，在相同濃度順鉑作用下，A-549細胞存活率及克隆形成率均隨著4-AN濃度的增加而減少，呈明顯劑量反應(yīng)關(guān)系，提示4-AN可以濃度依賴得增加順鉑對A549細胞的殺傷作用。

DNA是順鉑作用的重要靶分子之一。DNA單雙鏈斷裂是順鉑造成的DNA損傷中較常見的形式，且其損傷的修復(fù)是一個關(guān)系細胞最終轉(zhuǎn)歸的極為重要的過程。以往研究證明，腫瘤細胞DNA單雙鏈修復(fù)能力較強是其耐藥的主要機制之一［8］，若腫瘤細胞的DNA損傷不能被及時修復(fù)，則DNA損傷將逐漸累積造成不可逆的染色體損傷，導(dǎo)致腫瘤細胞的死亡。彗星試驗(comet assay)也稱單細胞凝膠電泳試驗，是目前檢測DNA損傷最敏感的方法之一，不僅可以檢測DNA單雙鏈的斷裂、DNA交聯(lián)，還可以檢測DNA損傷的修復(fù)情況［9］。微核試驗是20世紀70年代發(fā)展起來的一種快速檢測多種染色體異常的短期致突變試驗［10］。本研究采用兩種不同遺傳學(xué)終點的經(jīng)典遺傳毒性試驗-單細胞凝膠電泳試驗和微核試驗檢測4-AN與順鉑聯(lián)合作用后A549細胞的DNA及染色體損傷情況，試驗結(jié)果均顯示4-AN能增加順鉑對腫瘤細胞的遺傳損傷，提示4-AN具有順鉑增敏的作用。綜合上述細胞毒性試驗和遺傳毒性試驗的結(jié)果，我們推斷，順鉑是一種二價鉑同兩個氯原子和兩個氨分子結(jié)合的重金屬絡(luò)合物，類似于雙功能烷化劑，以腫瘤細胞DNA為靶點，其引起的以DNA單雙鏈為主的DNA損傷是其化療的主要作用機制。PARP-1的鋅指結(jié)構(gòu)域可識別結(jié)合于DNA單鏈斷裂，切割NAD+，將眾多腺苷二磷酸核糖單位連接至目標蛋白，最終可致高負性蛋白的形成，繼而可通過堿基切除修復(fù)途徑松解并修復(fù)損傷的DNA。而施以PARP抑制劑后可阻止此種修復(fù)過程，加劇DNA損傷，引起不可逆的染色體斷裂，最終導(dǎo)致肺腺癌細胞死亡，表現(xiàn)為細胞生長和克隆形成受抑。

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