白介素-18對肝癌裸鼠皮下移植瘤浸潤的CD4+T細(xì)胞子集的影響

史衛(wèi)紅，高勝利，宋祥和，卞勇華，Greg Brothers，李玉華，吳建成

(1.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鹽城 224006;2.蘇州大學(xué) 附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006;3.Department of Medical Biophysics，University of Toronto，Toronto，Ontario，Canada)

白介素-18(IL-18)具有誘導(dǎo)干擾素-γ(IFN-γ)產(chǎn)生、增強自然殺傷細(xì)胞(NK)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)細(xì)胞活性、誘導(dǎo)Thl細(xì)胞分化等多種生物學(xué)功能，具有強大的抗腫瘤作用［1］。Nagai等［2］將 IL-18轉(zhuǎn)入黑色素瘤B16F10細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染IL-18能抑制移植瘤新生血管形成。近年來，IL-18的抑制腫瘤血管生成作用被一系列研究證實［3-4］。本實驗中采用不同劑量的IL-18體內(nèi)干預(yù)人肝癌細(xì)胞株HepG2肝癌裸鼠皮下移植瘤生長，流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤組織及脾組織中 IFN-γ+IL-17+CD4+T、Th17、Th1細(xì)胞，探討IL-18影響肝癌裸鼠皮下移植瘤浸潤的T細(xì)胞子集變化的機制。

1 材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2由蘇州大學(xué)肝病研究中心提供;IL-18，加拿大多倫多大學(xué)蛋白質(zhì)中心實驗室主任Greg Brothers教授提供;細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清(BSA)，杭州四季青公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、DAB-HCL顯色劑、過氧化氫甲醇溶液、羊血清，上海華美公司;淋巴細(xì)胞分離液(ficoll分離液)，上海華精生物公司;DMEM、新生小牛血清(FBS)、RMPI 1640培養(yǎng)基，Hyclone公司;佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、離子霉素(ionomycin)，Sigma 公司;布雷菲德菌素A(brefeldin A，BFA)，Alexis公司;藻紅蛋白(PE)標(biāo)記抗鼠IL-17、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗鼠IFN-γ抗體，eBioscience公司。

免疫磁珠陰選試劑盒(Dynabeads Untouched Human CIM T細(xì)胞)，Dvnal公司;固定與透膜試劑盒(FIX/PERM)，Caltag公司。

FACS Calibur流式細(xì)胞儀，BD公司。

BALB/c裸鼠，雌雄各半，鼠齡5周，體重14.5～17.5 g，購于中國科學(xué)院上海動物中心，動物合格證號:SCXK(滬)2007-0005，在蘇州大學(xué)新校區(qū)動物中心SPF級條件下由中心工作人員統(tǒng)一飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 肝癌細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

凍存的 HepG2細(xì)胞復(fù)蘇成功后，采用 RPMI 1640完全培養(yǎng)基，制備細(xì)胞懸液，37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中孵育，培養(yǎng)后第1天即可見細(xì)胞數(shù)的增加，第3～8天為指數(shù)增殖期，第10天達(dá)到最大密度。用0.25%胰蛋白酶(含0.01%EDTA)消化，制成細(xì)胞懸液，含細(xì)胞數(shù) 5.0 ×106個/0.1 mL，臺盼藍(lán)測定細(xì)胞活力在95%以上。

2.2 裸鼠肝癌皮下移植瘤模型的建立及給藥

將HepG2細(xì)胞懸液0.1 mL注入裸鼠左前肢皮下，模型鼠分為4組，每組6只，分別腹腔注射IL-18 0.75，1.00，1.25，0(模型組)μg/只，給藥體積均為0.1 mL，連續(xù)給藥4周，觀察裸鼠生長及成瘤情況。另設(shè)正常對照組，給予等體積的生理鹽水。

2.3 HE染色

10%福爾馬林固定裸鼠皮下移植瘤組織塊，常規(guī)石蠟制片，切片厚度為4 μm，HE染色觀察移植瘤組織病理變化。

2.4 裸鼠腫瘤生長情況觀察以及皮下移植瘤組織淋巴細(xì)胞的分離

瘤細(xì)胞接種后觀察裸鼠體重、精神狀態(tài)、食欲、對外界的反應(yīng)等，每次注射藥物的同時，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最大直徑和最小直徑。4周后用摘眼球法取血，用頸椎脫位法處死動物，剝離腫瘤和脾臟組織。取小塊腫瘤組織浸入10%福爾馬林溶液中留作病理檢查。將獲得組織塊經(jīng)RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌去除血液，切成2～3 mm大小的組織塊，放入50 mL離心管內(nèi)，用RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌2～3次(每次1 000 r/min離心2～3 min)，棄盡上清;加入適量消化液，37℃，80 r/min振蕩消化30～60 min，1 500 r/min離心 5 min，棄上清，RPMI 1640或DMEM重懸，經(jīng)120目鋼絲網(wǎng)過濾，去除組織等，將收集到的細(xì)胞懸液5 mL渦旋后沿管壁緩慢加入含有Ficoll 5 mL的離心管中，重懸細(xì)胞，離心，吸取中間層細(xì)胞。

2.5 移植瘤組織CD4+T細(xì)胞的分離及胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測

離心收集待分離細(xì)胞，用少量 PBE孵育液(0.5%BSA、0.08%EDTA、pH 7.2 磷酸鹽緩沖液)充分混懸細(xì)胞，然后根據(jù)免疫磁珠陰選試劑盒操作說明分選出CD4+T細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)測定純度達(dá)90%以上。以含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，顯微鏡下計數(shù)(終濃度為1×106/mL)。吸取細(xì)胞懸液200 μL至96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，在分離的淋巴細(xì)胞中分別加入10 μg/mL PMA l μL和100 μg/mL 離子霉素2 μL 以及 300 μg/mL BFA 22 μL，使其終濃度分別為50 ng/mL，1 μg/mL 和3 μg/mL，將細(xì)胞放在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)4～5 h。然后取細(xì)胞懸液100 μL，4℃避光孵育15 min，用 pH 7.4磷酸鹽緩沖液(含0.1%NaN3和5%FBS)3 mL洗滌，離心棄上清，再加入透膜劑100 μL，反應(yīng)5 min 1 800 r/min離心棄上清。用大鼠血清50 μL封閉10 min，pH 7.4磷酸鹽緩沖液洗2次，分別加入PE-anti-mouse-IL-17和FITC-anti-mouse-IFN-γ 0.25 μL，室溫避光 30 min，通透洗液洗2遍，以pH 7.4磷酸鹽緩沖液200 μL重懸細(xì)胞后，上機檢測，結(jié)果用cellquest軟件分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均利用SPSS15.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行相關(guān)分析和統(tǒng)計，多組數(shù)據(jù)組間分析使用單因素方差分析(one way ANOVA分析)，率的比較采用卡方檢驗或Fisher確切檢驗;多個獨立樣本等級資料比較采用Kruskal-Walis H檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney-U檢驗:統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)概率檢驗(α=0.05)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 裸鼠皮下移植瘤模型的建立及IL-18對肝癌皮下移植瘤重量、體積及抑瘤率的影響

HepG2細(xì)胞順利培養(yǎng)并傳代，成功建立鼠皮下移植瘤(圖1)，其腫瘤標(biāo)本切片病理提示均為肝細(xì)胞癌(圖2);部分移植瘤壞死，出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移灶。不同劑量組治療組腫瘤重量顯著輕于對照組(P＜0.05)，但是治療組間比較無顯著差異(P ＞0.05)，見圖3，在后期實驗中不同療程組提示IL-18早期長療程治療效果更佳(將另文發(fā)表)。從不同劑量組腫瘤生長曲線(圖4)可以看出，IL-18治療組腫瘤體積生長明顯比未治療組慢，從兩周時，已有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。隨著劑量的增加，腫瘤體積愈小，抑瘤效果愈加明顯，故后期不同療程實驗組采取最大組劑量治療。

圖1 不同劑量組裸鼠移植瘤比較Fig.1 Comparison with transplantation tumors between different dosage groups in nude mice

圖2 皮下移植瘤(HE染色 ×400)Fig.2 Transplantation tumors intradermally(HE stain ×400)

圖3 不同劑量組治后裸鼠瘤重柱形圖Fig.3 Comparison with weight of transplantation tumors between different dosage groups in nude mice with histogram

圖4 不同劑量組裸鼠瘤體積生長曲線Fig.4 Comparison with volume of transplantation tumors between different dosage groups in nude mice with growth curve

3.2 正常組皮下組織、脾組織及裸鼠移植瘤模型不同劑量組腫瘤組織、脾組織中CD4+T細(xì)胞子集的檢測

IL-17+/IFN-γ+CD4+T細(xì)胞和Th17細(xì)胞在裸鼠移植瘤模型的腫瘤組織和脾組織中均升高;IL-18給藥組CD4+T細(xì)胞中IFN-γ陽性細(xì)胞增多，而IL-17+/IFN-γ+CD4+T細(xì)胞和Th17細(xì)胞下降，治療組間比較差異無顯著性;但模型組、治療組及正常對照組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1～2和圖5。

表1 不同組CD4+T細(xì)胞子集在皮下組織和移植瘤中的表達(dá)(± s，n=6)Tab.1 CD4+T cell subset expression of subcutaneous tissue and transplantation tumor in different groups(± s，n=6)

表1 不同組CD4+T細(xì)胞子集在皮下組織和移植瘤中的表達(dá)(± s，n=6)Tab.1 CD4+T cell subset expression of subcutaneous tissue and transplantation tumor in different groups(± s，n=6)

與正常對照組比較:1P ＜0.05，2P ＜0.01;與模型組比較:3P ＜0.05，4P ＜0.01Compared with control:1P ＜0.05，2P ＜0.01;Compared with model group:3P ＜0.05，4P ＜0.01

組 別 劑量/(μg/只) IFN-γ+/% IFN-γ+IL-17+/% IL-17+/%正常對照組-10.43 ±0.87 0.82 ±0.27 2.35 ±1.73 IL-18 組 0.75 7.78 ±2.031，3 1.12 ±0.533 4.87 ±1.791，3 1.00 8.07 ±1.011，3 1.09 ±0.703 4.52 ±1.121，3 1.25 8.53 ±0.871，3 0.92 ±0.383 3.98 ±0.621，3模型組 0 5.35 ±1.322，4 2.33 ±0.821 6.05 ±2.152

表2 不同組CD4+T細(xì)胞子集在脾組織中的表達(dá)(± s，n=6)Tab.2 CD4+T cell subset expression of spleen tissues in different groups(± s，n=6)

表2 不同組CD4+T細(xì)胞子集在脾組織中的表達(dá)(± s，n=6)Tab.2 CD4+T cell subset expression of spleen tissues in different groups(± s，n=6)

與正常對照組比較:1P ＜0.05，2P ＜0.01;與模型組比較:3P ＜0.05，4P ＜0.01Compared with control:1P ＜0.05，2P ＜0.01;Compared with model group:3P ＜0.05，4P ＜0.01

組 別 劑量/(μg/只) IFN-γ+/% IFN-γ+IL-17+/% IL-17+/%正常對照組-11.43 ±2.07 1.02 ±0.32 2.45 ±1.03 IL-18 組 0.75 7.93 ± 2.031，3 1.12 ±0.833 4.67 ±1.761，3 1.00 8.57 ± 1.411，3 1.07 ±0.403 4.98 ±1.311，3 1.25 8.93 ± 1.921，3 1.03 ±0.593 4.39 ±1.061，3模型組 0 5.75 ± 1.802，4 2.37 ±1.021 6.23 ±2.142，4

圖5 各組裸鼠組織中CD4+T細(xì)胞子集的表達(dá)Fig.5 CD4+T cell subset expression in each group

4 討論

本研究以裸鼠為載體建立人肝癌動物模型，用不同劑量的IL-18抗裸鼠移植瘤治療，取得了預(yù)期的效果(與實驗前期予不同療程IL-18抗裸鼠移植瘤療效一致，數(shù)據(jù)將另外發(fā)表)。

Micallef等［5］研究發(fā)現(xiàn)，腹腔內(nèi)和靜脈內(nèi)注射重組IL-18可引發(fā)機體對自體MethA肉瘤產(chǎn)生抗瘤效應(yīng)，延長荷瘤鼠的生存期;Cao等［4］研究表明IL-18可抑制雞胚胎的血管形成，在體內(nèi)IL-18能特異性抑制纖維母細(xì)胞生長因子2(fibroblast growth factor-2)誘導(dǎo)引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖;Ohtsuki等［6］發(fā)現(xiàn)，重組IL-18能上調(diào)鼠脾NK細(xì)胞Fas表達(dá)，提高Fas對靶細(xì)胞的敏感性，從而誘導(dǎo)Fas介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡。IL-18作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，可以刺激Thl細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，促進(jìn)Thl增殖及Fas介導(dǎo)的Thl細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。但Yoshida等［7］把IL-18基因經(jīng)病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染到接種胰癌細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)，并沒有觀察到抗腫瘤的效果。這些提示我們，IL-18對于多種腫瘤有抗腫瘤作用，但I(xiàn)L-18的抗腫瘤效應(yīng)機制仍有爭議［8-9］，IL-18抗腫瘤作用可能與個體差異或與腫瘤發(fā)生的組織、器官、細(xì)胞株有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，IL-18能明顯抑制裸鼠肝癌皮下移植瘤的生長，不同劑量治療組裸鼠均生存良好，未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。IL-18在治療后第1周就已經(jīng)顯示其抑制腫瘤生長的作用，自第2周后抑制作用更明顯，且劑量越大，療程越長抑制作用更顯著。

IL-18是一種重要的細(xì)胞正向免疫調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫平衡，發(fā)揮免疫監(jiān)視功能起很重要的作用。Wakita等［10］在體外誘導(dǎo)，腫瘤抗原特異性Th17(αβCD4+T)或 Tc(αβCD8+T)可轉(zhuǎn)化為 IFN-γ+T細(xì)胞，當(dāng)遷移進(jìn)產(chǎn)生腫瘤的裸鼠后，可根除腫瘤細(xì)胞。Th1主導(dǎo)的免疫效應(yīng)能克服強烈的免疫抑制，能完全治愈鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生的腫瘤。因此，本研究通過不同劑量IL-18治療誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生，檢測CD4+T細(xì)胞子集在各組腫瘤組織、脾臟組織和正常對照組中的變化。

Sutton 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在缺乏 IFN-γ 時 CD4+T細(xì)胞可分化為產(chǎn)生IL-17的Th17細(xì)胞，IL-17的生成產(chǎn)生正反饋作用，放大Th17的反應(yīng)和自身免疫性疾病。而IL-18通過誘導(dǎo)IFN-γ的生成促進(jìn)Th1細(xì)胞的生成，呈正反饋效應(yīng)放大Th1及其細(xì)胞因子的生成，發(fā)揮機體的免疫監(jiān)視功能［12］。

在腫瘤微環(huán)境中，IL-17可能通過上調(diào)一些血管源性因子，促進(jìn)腫瘤組織新生微血管的形成，加劇了腫瘤的病理進(jìn)展［13］。Wakita 等［10，14］通過裸鼠實驗?zāi)Ｐ妥C明IL-17可能通過促進(jìn)血管生成，促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲與轉(zhuǎn)移;并通過分子調(diào)節(jié)機制放大Th17細(xì)胞生成，抑制IFN-γ生成，下調(diào)細(xì)胞毒活性。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組腫瘤組織和脾組織中Th17細(xì)胞和IL-17+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞顯著增加，通過外源性IL-18治療明顯抑制皮下裸鼠移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移，各組織中IL-17+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞數(shù)量減少，隨著給藥劑量的增加和時間的延長，Th17細(xì)胞數(shù)量呈逐漸減少趨勢，但其機制還不清楚。可能IL-17+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞在腫瘤環(huán)境中增加與Th17細(xì)胞分化有關(guān)，而IL-18可能通過誘導(dǎo)IFN-γ抑制其作用促進(jìn)其向Th1細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，研究結(jié)果也提示給予IL-18后，IFN-γ在組織中增加。Thl7細(xì)胞在腫瘤免疫中的作用還存在著爭議［15-16］，或許Th17細(xì)胞具有多效性，依據(jù)腫瘤的類型及免疫能力等而發(fā)揮促進(jìn)或抑制腫瘤的功效。

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