通心絡對糖尿病大鼠心肌纖維化的防治作用

王小梅，穆長征，趙田田，楊穎婷

(1.遼寧醫(yī)學院 附屬第一醫(yī)院，2.遼寧醫(yī)學院，遼寧 錦州 121001)

糖尿病心肌病是糖尿病的微血管病變之一，獨立于高血壓和冠狀動脈病變發(fā)生，1972年由Rubler首次提出，其發(fā)病機制比較復雜，可能與能量代謝異常、氧化應激、腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活、炎癥反應等有關，病理改變包括細胞凋亡、心肌肥大和心肌纖維化等。近年來研究發(fā)現(xiàn)心肌組織轉化生長因子-β1(TGF-β1)/Smad信號通路活化與糖尿病心肌病的發(fā)病有密切關系［1-2］。通心絡膠囊是根據(jù)中醫(yī)絡病理論研制而成的含多種蟲類的中藥復方制劑［3］，臨床用于治療冠心病心絞痛取得良好療效，并在高血壓大鼠和病毒性心肌炎小鼠發(fā)病過程中具有明顯抗心肌纖維化作用。超微粉碎(干粉)的通心絡是對通心絡膠囊中動物藥進行超微粉碎，有利于有效成分的溶解和釋放，使中藥的生物利用度更高、吸收更充分、藥效更好［4］。本研究將通心絡干粉用于鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠，觀察其對糖尿病大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad3和Smad7的表達的影響，探討通心絡對糖尿病大鼠心肌纖維化的防治作用及可能的機制。

1 材料

通心絡干粉(主要由人參、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鱉蟲、赤芍、蟬蛻、冰片組成)，每1 g干粉相當于生藥1.43 g，河北以嶺醫(yī)藥研究院，批號:070406。

兔抗鼠 TGF-β1、Smad3、Smad7抗體，北京博奧森生物有限公司。

引物合成設計由大連寶生物工程有限公司進行引物合成。

血糖測定儀，美國強生公司SureStep Plus(穩(wěn)步倍加型);CTAS-1000細胞圖像分析儀，北京大恒圖像視覺有限公司。

健康雄性SD大鼠，鼠齡7～8周，體重180～220 g，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號:SYXK(遼)2005-0013。

2 方法

2.1 糖尿病模型的建立、分組及標本取材

SD大鼠40只，其中10只作為正常對照組(注射等量0.5 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液)，另外30只尾靜脈注射1%STZ溶液(用 pH 4.5，0.5 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液配制)45 mg/kg。72 h后尾靜脈取血測定血糖，以血糖濃度大于16.7 mmol/L定為糖尿病模型建立標準。將糖尿病大鼠隨機分為2組:糖尿病模型組和通心絡組。參照文獻［5］，通心絡組給予通心絡干粉0.5 g/kg，溶于水中后灌胃給藥，正常對照組和糖尿病模型組灌胃相同體積的水，共12周。12周末，稱體重，腹腔注射20%烏拉坦溶液0.5 mL/100 g麻醉，取心臟，4℃生理鹽水漂洗后濾紙吸干全心稱重，去除心房、右心室，稱左心室重，將左室心肌標本橫切分為兩份，中下段凍存于－80℃冰箱，用于RT-PCR檢測。左室中上段取5 mm3心肌組織，迅速放入10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片用于光鏡及TGF-β1，Smad3和Smad7蛋白的免疫組織化學測定。

2.2 血糖、心臟重量指數(shù)、左室重量指數(shù)測定

尾靜脈取血，血糖儀及血糖測定試紙測血糖。計算大鼠心臟重量指數(shù)(全心重量/體重)和左心室重量指數(shù)(左心室重量/體重)。

2.3 膠原容積積分(CVF)測定

取心肌組織5 mm3，迅速放入10%甲醛溶液中固定后組織脫水，石蠟包埋，制備組織切片行HE染色及VG膠原染色(在VG染色下，心肌細胞、紅細胞呈黃色，間質膠原纖維呈紅色)。鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)學變化，圖像分析儀測量CVF。

2.4 免疫組化測定心肌中TGF-β1、Smad3及Smad7的蛋白表達

心肌組織切片常規(guī)二甲苯、梯度乙醇脫蠟、抗原修復，血清封閉，滴加一抗，4℃冰箱過夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。顯微鏡下見棕黃色為陽性表達。每組標本切片隨機選取10個高倍視野，采用CTAS-1000細胞圖像分析儀計算各組陽性表達平均灰度值，進行分析。

2.5 RT-PCR 法檢測 TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA表達

?。?0℃凍存的心肌組織，置入盛有液氮的研缽中，加入Trizol 1 mL，用研磨棒仔細研磨，抽取勻漿，提取總RNA。按照RT-PCR試劑盒說明書進行RT-PCR檢測。TGF-β1的引物:上游:5'ATGGTGGACCGCAACAAC3'， 下 游:5'TGAGCACTGAAGCGAAAGC3'，擴增片段長度為329 bp;Smad3的引物:上游:5'GATGTGGCTGGGAAATAC3'，下游:5'TTCTAGTCAGTCTGCCTGTAC3'，擴增片段長度為74 bp;Smad7的引物:上游:5'CCCTTTGGATCAGCATTTC3'，下游:5'GGTTCTGGTTCAGCCTTCTA3'，擴增片段長度為 345 bp;β-actin的引物:上游:5'GAAATCGTGCGTGACATTA3'，下 游:5'GGACTCATCGTACTCCTGCT3'，擴增片段長度為 477 bp。PCR反應條件:94℃預變性5 min;94℃ 30 s;退火30 s;72℃延伸30 s，72℃ 7 min，4℃保存，33個循環(huán)。取PCR產物5 μL在2%瓊脂糖凝膠上電泳，結果在凝膠成像系統(tǒng)上掃描，通過圖像分析系統(tǒng)測定光密度值檢測 TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA 表達相對含量。

2.6 統(tǒng)計分析

用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)用(x±s)表示，組間比較采用方差分析，組間兩兩比較用q檢驗。

3 結果

3.1 大鼠一般情況

注射STZ后，大鼠逐漸出現(xiàn)多尿、多飲、多食等糖尿病癥狀，體重增長緩慢，伴有不同程度的精神萎靡，皮毛稀疏無光澤，2只大鼠血糖低于16.7 mmol/L，棄去，至實驗末糖尿病模型組大鼠因感染或糖尿病加重死亡2只;通心絡組死亡1只，其余25只大鼠均達到成模標準。

3.2 通心絡對糖尿病大鼠血糖、心臟重量指數(shù)和左心室重量指數(shù)的影響

12周時，糖尿病模型組大鼠血糖明顯高于正常對照組，心臟重量指數(shù)和左心室重量指數(shù)明顯升高;通心絡組與糖尿病模型組相比，血糖無明顯差異，心臟重量指數(shù)和左心室重量指數(shù)明顯降低，但仍高于正常對照組，見表1。

3.3 CVF 的變化

與正常對照組相比，糖尿病模型組大鼠CVF明顯增高;與糖尿病組相比，通心絡組CVF明顯降低，但仍高于正常對照組，見表1。

3.4 大鼠心肌TGF-β1、Smad3及Smad7的蛋白表達

正常對照組大鼠心肌TGF-β1、Smad3的蛋白表達在心肌細胞漿中、細胞外周、血管周圍出現(xiàn)棕黃色顆粒物質，呈弱陽性改變，而Smad7的蛋白表達呈強陽性;糖尿病模型組大鼠心肌TGF-β1、Smad3的蛋白表達呈強陽性，而Smad7表達明顯減少;與糖尿病模型組比較，通心絡組TGF-β1、Smad3表達明顯減少而Smad7表達明顯增多。見表2。

3.5 大鼠心肌 TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA 的含量測定

與正常對照組比較，糖尿病模型組 TGF-β1、Smad3mRNA表達顯著增強，Smad7mRNA表達顯著下降;與糖尿病組相比，通心絡組 TGF-β1、Smad3mRNA表達顯著降低，Smad7mRNA表達顯著增高。見表3和圖1。

表1 三組大鼠血糖、心臟重量指數(shù)、左心室重量指數(shù)及CVF的比較(x±s)Tab.1 The comparison of blood glucose，heart weight index，left ventricular weight index and CVF in the three groups(x±s)

表2 三組大鼠心肌TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表達比較(x±s)Tab.2 The expression levels of TGF-β1，Smad3，Smad7protein in the three groups(x±s)

表3 三組大鼠心肌TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA表達比較(x±s)Tab.3 The expression levels of TGF-β1，Smad3，Smad7mRNA in the three groups(x±s)

4 討論

糖尿病心肌病是糖尿病的嚴重并發(fā)癥之一。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，心肌間質膠原纖維沉積和心肌纖維化是糖尿病心肌病變的一種重要特征，心肌纖維化增加了心室壁僵硬度，降低了心室順應性，致心室舒縮功能障礙，早期以舒張功能障礙為主，最后發(fā)展為收縮功能不全。有研究表明，TGF-β1過度表達可促進心肌纖維化和心肌肥厚而導致心室重構，參與心肌纖維化發(fā)生的早期過程［6］。TGF-β1是一類多功能細胞因子，在纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要重要，是組織器官纖維化的主要調控因子之一［7］，其高表達具有促組織發(fā)生纖維化的病理作用，它可促進細胞外基質的合成與分泌，減少細胞外基質的降解;增加膠原與基質蛋白的生成;最終導致心肌細胞外基質的沉積，從而引起心肌纖維化［8］，本研究結果顯示，糖尿病模型組大鼠心肌TGF-β1、TGF-β1mRNA的表達水平顯著高于對照組，說明糖尿病大鼠心肌纖維化可能與 TGF-β1過度表達有關，該結果與章怡袆等［9］的結果一致。而通心絡組TGF-β1表達有所減少，說明通心絡可降低糖尿病心肌病中TGF-β1的表達，從而緩解糖尿病心肌病的發(fā)生與發(fā)展。

圖1 RT-PCR觀察鼠心肌組織TGF-β1mRNA(A)、mad3mRNA(B)和mad7mRNA(C)表達Fig.1 The expression of TGF-β1mRNA(A)，mad3mRNA(B)and mad7mRNA(C)in heart muscle tissue with the way of RT-PCR

Smad作為TGF-β1的細胞內信號轉導蛋白，同樣參與了糖尿病心肌病病理改變。已有研究證實心臟Smad可能在新生血管形成、心肌肥厚和心力衰竭中發(fā)揮重要作用，其中，Smad7為抑制性Smads蛋白(I-Smads)，被認為是TGF-β1信號轉導通路上最重要的負性調節(jié)因子之一，可與Smad2、Smad3競爭性結合 TGF-β1，阻止 Smad2、Smad3磷酸化而阻斷TGF-β1信號向下傳導［10-11］。本研究觀察到，糖尿病大鼠心肌Smad3、Smad3mRNA表達增加，而Smad7、Smad7mRNA的表達減少，提示Smad3可能參與了糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展過程，Smad7通過對TGF-β1信號轉導通路上最重要的負性調節(jié)，使TGF-β1表達減少，從而起到對糖尿病心肌病的保護作用。通心絡干粉主要由人參、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鱉蟲、赤芍、蟬蛻、冰片組成，趙田田等［12］通過實驗發(fā)現(xiàn)通心絡降低心肌基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、組織型基質金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)與TGF-β1蛋白的表達及含量，起到預防糖尿病心肌纖維化的作用，而本研究發(fā)現(xiàn)通心絡組明顯上調Smad7、Smad7mRNA的表達，下調Smad3、Smad3mRNA的表達，表明通心絡可影響 TGF-β1的細胞內信號轉導，通過下調TGF-β1、Smad3的表達和上調 Smad7表達，減輕心肌纖維化，進而對糖尿病大鼠心肌組織起到保護作用。由于通心絡的配方是含多種蟲類中藥的復方制劑，目前尚不清楚發(fā)揮上述作用的是單一成分還是復合成分，有待于進一步研究。

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