雌性老年大鼠紅核NGF及其相關(guān)受體的增齡性變化

趙 璇，王 蘭，鄭慧媛，崔媛媛，吳志新，石明娟

(西安醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，陜西 西安 710021)

衰老是機(jī)體各組織、器官功能隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)生退行性變化的過(guò)程。目前對(duì)實(shí)驗(yàn)性衰老大鼠或老年大鼠的研究多集中在模型動(dòng)物的認(rèn)知功能變化及相關(guān)機(jī)制研究方面;對(duì)于老年大鼠運(yùn)動(dòng)功能變化及相關(guān)機(jī)制研究較少。我們前期研究發(fā)現(xiàn)雌性老年大鼠的紅核NGF(nerve growth factor)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目及其高親和力受體TrkA陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目均較青年組大鼠顯著減少[1]。紅核(red nucleus，RN)為重要的錐體外系核團(tuán)，位于中腦腹側(cè)部，介于中央灰質(zhì)與內(nèi)側(cè)丘系之間，其主要功能是調(diào)節(jié)肌緊張和屈肌反射。對(duì)SD大鼠紅核神經(jīng)元的超徽結(jié)構(gòu)進(jìn)行電鏡觀察證明紅核神經(jīng)元隨增齡確實(shí)存在著一定的形態(tài)學(xué)改變[2]。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)屬神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族，其在神經(jīng)元的存活、發(fā)育、生長(zhǎng)和突觸可塑性方面顯示出了重要作用。成熟 NGF(mNGF，mature NGF)由其前體Pro-NGF裂解而來(lái)，mNGF和其受體TrkA相結(jié)合而發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元作用;而Pro-NGF和其受體p75NTR結(jié)合后，則誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。對(duì)衰老大鼠基底前腦、海馬的研究表明:神經(jīng)元mNGF及TrkA的表達(dá)減低和Pro-NGF及其受體p75NTR、復(fù)合受體sortilin的表達(dá)增高密切相關(guān);進(jìn)一步的研究表明Pro-NGF的表達(dá)增高可誘導(dǎo)其受體p75NTR表達(dá)增高、降低TrkA的表達(dá)，并誘導(dǎo)神經(jīng)元的退行性變[3]?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，本實(shí)驗(yàn)研究雌性老年大鼠在運(yùn)動(dòng)功能方面的變化，同時(shí)研究雌性老年大鼠的紅核mNGF、TrkA表達(dá)與Pro-NGF及其受體p75NTR、復(fù)合受體sortilin的表達(dá)的關(guān)系，探索老年大鼠紅核NGF及其相關(guān)受體的增齡性變化。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

20只22月齡、體重320～340 g雌性SD大鼠作為老年組，20只3月齡、體重220～240 g的雌性大鼠作為青年組。動(dòng)物由西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要儀器和試劑

網(wǎng)屏(50 cm×40 cm×30 cm鐵絲網(wǎng)箱，四周為木板框，網(wǎng)眼1 cm×1 cm，中山大學(xué)儀器廠制)，平衡木(直徑2.5 cm，未打磨，中山大學(xué)儀器廠制)，尼龍繩(直徑 0.5 cm，自制)。兔抗鼠 NGF、兔抗鼠p75NTR、兔抗鼠 sortilin抗體均購(gòu)自 Santa Crutz公司;兔抗鼠TrkA、β-actin抗體和兔SABC試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自Pierce公司;RIPA裂解液、BCA法蛋白定量試劑盒和SDS-PAGE低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)購(gòu)自北京百泰克公司;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和硝酸纖維素(NC)膜購(gòu)自Sigma公司。

1.3 大鼠運(yùn)動(dòng)功能實(shí)驗(yàn)

先將大鼠放于直徑約1 m的盆中活動(dòng)5 min，然后進(jìn)行測(cè)試。①網(wǎng)屏握持試驗(yàn):將鐵絲網(wǎng)箱水平放置，距離地面60 cm。將大鼠置于網(wǎng)箱底部后，迅速將網(wǎng)箱翻轉(zhuǎn)90℃，使其底部與地面垂直。記錄大鼠握持網(wǎng)箱的時(shí)間，允許最長(zhǎng)時(shí)間為15 s。②抓握牽引試驗(yàn):將直徑0.5 cm的尼龍繩水平系于距地面60 cm處。把大鼠前肢置于繩上后松手，不論后肢是否置于繩上，記錄其懸掛于繩上的時(shí)間，允許最長(zhǎng)時(shí)間為20 s。③平衡木試驗(yàn):將木棒水平放置于支架，距離地面60 cm，支架間距70 cm。將大鼠放于木棒中央后松手，記錄其落下時(shí)間，允許最長(zhǎng)時(shí)間為30 s。

1.4 Western Blot檢測(cè)

運(yùn)動(dòng)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，立即將大鼠麻醉，取腦，液氮速凍，貯存于-80℃冰箱備用。取灰結(jié)節(jié)中線至小腦前緣腦組織行連續(xù)冠狀冰凍切片(30 μm)，參考 Joachim F.R.K?nig版鼠腦圖譜從切片中取出紅核部位腦組織。將每組所分離組織混合后，與RIPA裂解液(含1 mmol/L的PMSF)按比例混合后勻漿，提取蛋白，應(yīng)用BCA法進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，并將各組樣品濃度調(diào)為一致。對(duì)變性蛋白質(zhì)進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。一抗為:NGF、TrkA、p75NTR、sortilin和β-actin抗體，濃度為1∶200，二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶500)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，兩組間差異用SNK法檢驗(yàn)，以P＜0.05為有顯著性差異。各種數(shù)據(jù)均以表示。Western Blot實(shí)驗(yàn)中用JY02S凝膠圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各蛋白條帶的平均光密度和面積，以二者的乘積表示各蛋白的表達(dá)量。每個(gè)樣本做3次，求平均值，以目的條帶與β-actin表達(dá)量的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)屏握持、抓握牽引及平衡木試驗(yàn)

在3項(xiàng)測(cè)試中，老年組大鼠與青年組大鼠相比，最長(zhǎng)停留時(shí)間均有顯著差異(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。網(wǎng)屏握持試驗(yàn)中，老年組大鼠上肢力量明顯減弱，脫網(wǎng)屏的上肢左右側(cè)概率大約相同;抓握牽引試驗(yàn)中，8只老年組大鼠后肢未能置于繩上，青年組大鼠后肢都可置于繩上;平衡木試驗(yàn)中，老年組大鼠平衡感覺(jué)較差，墜落較快，青年組大鼠的停留時(shí)間明顯長(zhǎng)于老年組。

表1 兩組網(wǎng)屏握持、抓握牽引及平衡木試驗(yàn)最長(zhǎng)停留時(shí)間(s，，n=10)

表1 兩組網(wǎng)屏握持、抓握牽引及平衡木試驗(yàn)最長(zhǎng)停留時(shí)間(s，，n=10)

#P ＜0.05

平衡木最長(zhǎng)停留時(shí)間青年組組別 網(wǎng)屏握持最長(zhǎng)停留時(shí)間抓握牽引最長(zhǎng)停留時(shí)間12.6 ±2.3 16.7 ±2.8 11.8 ±1.9老年組 9.6 ±3.6# 11.7 ±3.2# 7.4 ±3.0#

2.2 Western Blot結(jié)果

2.2.1 Pro-NGF 和 mNGF 蛋白的變化

本實(shí)驗(yàn)所用的兔抗鼠NGF抗體可同時(shí)識(shí)別Pro-NGF和 mNGF，Pro-NGF在 32 kDa條帶處，而mNGF在14 kDa條帶處。結(jié)果表明:在紅核中，與青年組大鼠相比，老年組大鼠Pro-NGF表達(dá)水平上升，而mNGF表達(dá)水平下降(見(jiàn)圖1)。兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.05。

圖1 Pro-NGF、mNGF在青年組和老年組大鼠紅核中的表達(dá)1、2、3 是青年組，4、5、6 是老年組

2.2.2 NGF受體和 Sortilin蛋白的變化

在紅核中，相對(duì)于青年組大鼠，老年組大鼠的TrkA表達(dá)水平明顯下降(見(jiàn)圖2)，而老年組大鼠紅核中p75NTR、sortilin的表達(dá)水平明顯上升(見(jiàn)圖3、4)。兩組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。

圖2 TrkA在青年組和老年組大鼠紅核中的表達(dá)1、2、3 是青年組，4、5、6 是老年組

圖3 p75NTR在青年組和老年組大鼠紅核中的表達(dá)1、2、3 是青年組，4、5、6 是老年組

圖4 Sortilin在青年組和老年組大鼠紅核中的表達(dá)1、2、3 是青年組，4、5、6 是老年組

3 討論

研究表明NGF對(duì)坐骨神經(jīng)損傷后脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元AchE活性恢復(fù)有促進(jìn)作用，從而對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元起一定的保護(hù)作用和促進(jìn)恢復(fù)作用[4]。正常情況下mNGF結(jié)合于高親和力受體TrkA發(fā)揮其維持神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育及正常功能的作用;proNGF主要和其高親和力受體p75NTR特異性結(jié)合從而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[5]。進(jìn)一步研究表明，proNGF和其受體p75NTR及sortilin形成三聚體發(fā)揮其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[6]。

在衰老過(guò)程中不但有認(rèn)知、記憶功能的衰退，運(yùn)動(dòng)功能、協(xié)調(diào)平衡能力也逐漸出現(xiàn)衰退。本實(shí)驗(yàn)證明:老年大鼠在網(wǎng)屏握持、抓握牽引及平衡木試驗(yàn)中明顯差于青年組大鼠，其前肢力量及平衡感覺(jué)明顯衰退。在嚙齒類動(dòng)物，紅核脊髓束軸突終末分部于下頸髓前角，與其內(nèi)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系，參與支配前肢關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)[7]。對(duì)SD大鼠紅核神經(jīng)元進(jìn)行電鏡觀察發(fā)現(xiàn):紅核神經(jīng)元核周體中脂褐素隨增齡增多，其附近線粒體的形態(tài)有所改變，核周體中其他細(xì)胞器隨增齡也有一定程度的形態(tài)改變;并且隨增齡出現(xiàn)核膜內(nèi)折現(xiàn)象及微絲纏繞線粒體群的現(xiàn)象[2]。以上結(jié)果表明:老年大鼠運(yùn)動(dòng)功能、協(xié)調(diào)平衡能力的衰退和紅核神經(jīng)元的衰退相關(guān)。

前期應(yīng)用免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)雌性老年大鼠的紅核NGF陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目及TrkA陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目均較青年組大鼠顯著減少[1]。這提示NGF和其受體TrkA表達(dá)和大鼠紅核的增齡性衰退及運(yùn)動(dòng)功能衰退密切相關(guān)。但免疫組化應(yīng)用的兔抗鼠NGF抗體不能區(qū)分mNGF和proNGF，更為重要的是mNGF和proNGF對(duì)神經(jīng)元的作用是截然不同的。為明確老年大鼠紅核中NGF及其相關(guān)受體變化的具體機(jī)制，本研究應(yīng)用WesternBlot技術(shù)，結(jié)果表明:在紅核中，相對(duì)于青年組大鼠，老年組大鼠的Pro-NGF表達(dá)水平上升，而mNGF表達(dá)水平下降;同時(shí)老年組大鼠的TrkA表達(dá)水平明顯下降，p75NTR、sortilin的表達(dá)水平明顯上升。以上結(jié)果提示:老年大鼠紅核中NGF信號(hào)途徑的變化和老年大鼠運(yùn)動(dòng)功能的衰退相關(guān);同時(shí)為針對(duì)NGF信號(hào)途徑特殊靶點(diǎn)的藥物開(kāi)發(fā)提供了線索。

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