高效液相色譜法測(cè)定亞甲基二磷酸含量

趙秀巖，王曉靜，付 博，葉肇云，柳銀黎

（原子高科股份有限公司，北京 102413）

亞甲基二膦酸（MDP）是雙磷酸類(lèi)藥物，在臨床上主要用于檢查骨骼的血供和代謝方面的病變；經(jīng)99TcO4－標(biāo)記后的產(chǎn)品（云克）用作類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎等疾病的治療劑。由于MDP生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)引入一些雜質(zhì)，這些雜質(zhì)（特別是亞磷酸）的存在可能會(huì)影響藥物臨床用藥的安全有效性，而且其用量也是嚴(yán)格控制的，因此MDP原料藥中亞磷酸含量分析是質(zhì)量控制中的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

MDP屬雙磷酸類(lèi)藥物，是一種焦磷酸類(lèi)似物，是將后者的P－O－P連接用P－C－P連接代替。由于其結(jié)構(gòu)中無(wú)生色團(tuán)，極性也較強(qiáng)，因此該類(lèi)藥物的質(zhì)量控制一般采用重量分析法［1］、酸堿滴定法［2］、絡(luò)合滴定法［3］和分光光度法［4］、柱前或柱后衍生反相高效液相色譜法［5－8］等方法。這幾種分析方法的缺點(diǎn)是特異性較差，其中柱前或柱后衍生法較繁瑣，而且僅能檢測(cè)到雙磷類(lèi)藥物，而不能對(duì)其分解產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)；其他幾種方法的特異性較差。本研究擬采用反相短碳鏈C8色譜柱以減少雙膦酸在柱上的吸附，配以通用型蒸發(fā)光散射器代替?zhèn)鹘y(tǒng)的紫外檢測(cè)器對(duì)各相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，以解決MDP及相關(guān)物質(zhì)的分離及檢測(cè)問(wèn)題。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和裝置

液相色譜系統(tǒng)：高效液相色譜儀（美國(guó)waters公司）、Alltech2000ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（美國(guó)奧泰公司）和CSChrom Plus色譜工作站（美國(guó)科學(xué)系統(tǒng)SSI公司）。

1.2 主要試劑

甲醇（色譜純）、磷酸二氫鈉和亞磷酸：均為國(guó)產(chǎn)分析純；MDP 對(duì)照品：Toronto Reserch Chemicals Inc提供；正戊胺：純度99%，美國(guó)Alfa Aesar產(chǎn)品。

1.3 色譜條件

色譜柱：Symmetry C8色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）：Waters公司；流 動(dòng)相：V （30 mmol／L正戊胺（用乙酸調(diào)節(jié)pH 5.0））∶V（甲醇）＝98∶2；流速：1mL／min。

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）：漂移管溫度110℃，氣體流量：2.7L／min；撞擊器位置：off，增益：1。在上述條件下，MDP的理論塔板數(shù)為2 141，分離度為10.4，拖尾因子0.97。

2 實(shí)驗(yàn)方法

分別將磷酸二氫鈉、亞磷酸、MDP對(duì)照品進(jìn)樣至高效液相色譜系統(tǒng)，采用反相高效液相色譜法分析其MDP含量，確定樣品的保留時(shí)間。在相同條件下對(duì)MDP原料進(jìn)行反相高效液相色譜分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)條件的確定

3.1.1 檢測(cè)器的選擇 MDP分子中有二個(gè)膦酸基體，極性強(qiáng)，易電離，分子結(jié)構(gòu)中無(wú)生色團(tuán)，因此不能用常規(guī)的紫外檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器間接檢測(cè)。由于ELSD是通用的質(zhì)量型檢測(cè)器，對(duì)檢測(cè)室中的各種物質(zhì)均有響應(yīng)，它的檢測(cè)不依賴(lài)于樣品分子中的官能團(tuán)，因此對(duì)于無(wú)生色團(tuán)的磷酸、亞磷酸、MDP等有關(guān)物質(zhì)可同時(shí)檢測(cè)，避免了衍生對(duì)分析的干擾，因此，本工作選用ELSD作為檢測(cè)器。

3.1.2 ELSD實(shí)驗(yàn)條件 ELSD的參數(shù)選擇主要是霧化氣體的流速和漂移管的溫度。以信噪比為考察指標(biāo)，考察了漂移管溫度對(duì)檢測(cè)器靈敏度的影響。結(jié)果顯示，溫度過(guò)低，流動(dòng)相揮發(fā)不完全、噪音大、雜峰多、信噪比?。粶囟冗^(guò)高，部分樣品揮發(fā)，且檢測(cè)的靈敏度降低。在溫度為110℃時(shí)，信噪比最大。因此選擇漂移管溫度為110℃。

霧化器氣體流量對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氣體流速過(guò)小，流動(dòng)相揮發(fā)不完全、背景噪音大；而流速過(guò)高，霧化形成的物質(zhì)微粒小、散射能力弱、靈敏度降低。當(dāng)空氣流速為2.7L／min時(shí)，樣品的信噪比最大，因此選擇霧化器氣體流量為2.7L／min。

3.1.3 離子對(duì)試劑的選擇 離子對(duì)反相液相色譜常用四丁基季銨鹽做離子對(duì)，但由于四丁基季銨鹽不具有揮發(fā)性，因此不能直接應(yīng)用于ELSD。本實(shí)驗(yàn)采用可揮發(fā)的正戊胺做為離子對(duì)試劑，結(jié)合ELSD檢測(cè)器，克服了四丁基季銨鹽離子對(duì)流動(dòng)性與ELSD不相匹配的缺點(diǎn)。

3.2 影響色譜行為的因素

在反相高效液相色譜中，影響物質(zhì)在色譜柱上保留的主要因素包括流動(dòng)相的pH、流動(dòng)相的濃度、流動(dòng)相中有機(jī)溶劑及無(wú)機(jī)溶劑的比例，通過(guò)實(shí)驗(yàn)考察了以上各因素對(duì)有關(guān)物質(zhì)色譜峰的影響，并確定實(shí)驗(yàn)的最佳條件。

3.2.1 pH對(duì)分離的影響 配制濃度30mol／L的正戊胺溶液，用乙酸調(diào)其pH為4～7，甲醇體積含量為2%，考察不同pH對(duì)磷酸、亞磷酸及MDP保留值的影響，結(jié)果示于圖1。圖1顯示，隨著pH增加，各組分保留值增加。譜峰變寬，當(dāng)pH為5.0時(shí)，譜峰最佳，且滿(mǎn)足分離要求，因此選擇流動(dòng)相的pH為5.0。

3.2.2 流動(dòng)相濃度的影響 分別配制濃度為25～40mmol／L正戊胺溶液（用乙酸調(diào)節(jié)pH至5.0），甲醇體積含量為2%，考察不同流動(dòng)相濃度對(duì)磷酸、亞磷酸及MDP保留值的影響，結(jié)果示于圖2。圖2顯示，隨著流動(dòng)相濃度的增加，各組分的保留值減小，磷酸及亞磷酸分離變差。為保證充分的分離，選用濃度30mol／L的正戊胺溶液。

3.2.3 甲醇含量的影響 甲醇體積含量為0～5%時(shí)對(duì)各組分的影響結(jié)果示于圖3。由圖3可以看出，隨著甲醇體積含量的增加，各組分的保留值減小，為保證各組分的充分分離，選用甲醇體積含量為2%。

3.3 最佳條件下的色譜分析

選用30mmol／L的正戊胺，pH 5.0，甲醇體積含量為2%時(shí)，MDP、磷酸及亞磷酸的色譜分離結(jié)果示于圖4。由圖4可以看出，MDP與其相關(guān)物質(zhì)在合適的保留時(shí)間內(nèi)達(dá)到良好的分離。

圖1 pH對(duì)保留值的影響▲——MDP；■——亞磷酸；◆——磷酸

圖2 流動(dòng)相濃度對(duì)保留值的影響▲——MDP；■——亞磷酸；◆——磷酸

圖3 甲醇體積含量對(duì)保留值的影響▲——MDP；■——亞磷酸；◆——磷酸

圖4 MDP與相關(guān)物質(zhì)的分離色譜圖1——磷酸；2——亞磷酸；3——MDP

3.4 線性范圍

MDP在600～4 000mg／L范圍內(nèi)峰面積A的對(duì)數(shù)值lgA濃度C對(duì)數(shù)值lgC呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：lgA＝1.943 6lgC＋16.212，r＝0.999 6，檢出限為200mg／L。

3.5 精密度與重復(fù)性

在優(yōu)化色譜條件下，取濃度為2.07g／L的MDP對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，MDP峰面積的相對(duì)偏差為1.07%。

3.6 回收率

取濃度為920mg／L和299mg／L MDP對(duì)照品溶液，按兩點(diǎn)法進(jìn)樣進(jìn)行色譜分析，并對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行線性回歸，另外配制3個(gè)已知濃度的MDP對(duì)照品溶液，做空白加樣回收，結(jié)果列于表1。由表1可以看出，回收率為98%～102%，符合檢測(cè)要求。

3.7 樣品測(cè)定

采用兩點(diǎn)法進(jìn)樣，對(duì)三批樣品進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果列于表2。由表2可見(jiàn)，MDP質(zhì)量含量為95.0%～98.1%，符合檢測(cè)要求。

表1 加樣回收率（n＝3）

表2 樣品測(cè)量結(jié)果（n＝3）

4 結(jié) 論

采用反相高效液相色譜法／ELSD測(cè)定MDP及有關(guān)物質(zhì)，方法的線性范圍為600～4 000mg／L，r＝0.999 6，檢出限為200mg／L，回收率在98%～102%，適用于MDP原料的質(zhì)量控制。

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