法醫(yī)DNA標準物質STR位點等位基因分型定值研究

趙興春， 孫 敬， 印 佳， 王 燕， 姜伯瑋， 高運華， 葉 健

（1.公安部物證鑒定中心，北京 100038；2.中國人民公安大學，北京 100038；3.中科院應用物理研究所，上海 201800；4.中國計量科學研究院，北京 100013）

0 引 言

短串聯(lián)重復序列（short tandem repeat，STR）又稱為微衛(wèi)星序列，是人類基因組DNA中分布較為廣泛的一類遺傳標記，其核心序列一般由2～6個堿基組成，核心序列的重復單位數(shù)目不同構成同一基因座中不同的等位基因。STR序列絕大多數(shù)分布于非編碼區(qū)，核心重復序列呈串聯(lián)排列，擴增片段一般在400bp以下，因而更適合于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，目前在法醫(yī) DNA分析中得到了廣泛應用[1]。法醫(yī)DNA標準物質是標準物質的一種，具體是指具有特定量值的DNA測量標準，能夠保證法醫(yī)DNA分析結果的有效性和可靠性，同時確保實驗室DNA分析結果的可比性及一致性[2-4]。目前，關于法醫(yī)DNA標準物質及其相關定值研究鮮有報道，直接導致法醫(yī)DNA標準物質出現(xiàn)無法溯源的問題，目前我國相關領域研究者已開始關注DNA標準物質的研究[5]。本文利用PCR方法對法醫(yī)DNA標準物質備選所用細胞樣本的基因組進行大量擴增，獲得相應的STR等位基因分型片段，并對目標片段進行測序分析，獲得分型定值，以期為法醫(yī)DNA標準物質的定值及溯源提供參考。

1 實驗材料

1.1 樣本

人胚肺成纖維細胞（human pulmonary fibroblast，HPF）和人胚胃平滑肌細胞（human stomach smooth muscle，HSSM），購自北京協(xié)和細胞資源中心；9947A購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 主要儀器

臺式離心機（賀利氏公司，Heraeus）；9700 型熱循環(huán)儀（Applied Biosystems公司）；超純水儀（Millipore公司）；SA-32型垂直電泳板（Whatman Biometra公司）。

1.3 主要試劑

低分子量 DNA Marker，購自 NEB公司；DNATyperTM15試劑盒，購自公安部物證鑒定中心；IdentifilerTM試劑盒和TaqGoldTM酶，購自Applied Biosystems公司；丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰、硼酸、冰醋酸、硝酸銀、甲醛、硫代硫酸鈉和氫氧化鈉購自北京化學試劑公司。

2 實驗方法

2.1 細胞樣本DNA的提取

細胞懸液離心去除細胞培養(yǎng)液，加入1mL生理鹽水重新懸浮細胞，取細胞懸液加入EDTA-Na2溶液、10%SDS及蛋白酶K，進行裂解。加入有機溶劑酚和氯仿，進行抽提，去除蛋白等雜質。吸上清于另一管，加入2.5倍體積冷無水乙醇，沉淀細胞DNA，加入TE緩沖液溶解DNA后4℃保存。

2.2 細胞樣本DNA單基因座STR擴增

PCR 總反應體積 10μL：5×PCR Mix 2.0μL、上/下游引物（見表1）各 0.2μL、Taq DNA聚合酶0.2μL、細胞樣本DNA模板1.0μL、去離子水6.4μL。

PCR熱循環(huán)參數(shù)：95℃，11 min預變性；94℃，1min，59℃，1min，72℃，1min，總共 30 cycles；60℃，60min；25℃保溫。

表1 STR基因座引物序列

2.3 擴增產(chǎn)物電泳及回收

將PCR產(chǎn)物于5%變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，電泳結束后凝膠經(jīng)銀染顯色。將染色過后的凝膠晾干，從凝膠上切割回收目標片段放入蒸餾水中，94℃溫浴20 min，使DNA片段從凝膠中釋放到水中。

2.4 目標DNA片段大量擴增及測序定值

取2μL含有目標DNA片段的溶液作模板進行大量擴增（方法同2.2），產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠檢測回收后送北京邁奧德恩生物公司測序。

3 結 果

3.1 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測

HPF、HSSM及9947A STR基因座分型結果見圖 1。STR基因座位點包括 D2S1358、D7S820、D8S1179、D13S317、TH01 及 CSF1PO。從圖中可以看出：HPF 在 D2S1358、D7S820、D8S1179、D13S317、TH01及CSF1PO均為雜合子；HSSM在D2S1358、D13S317、TH01 上為雜合子，在 CSF1PO、D7S820、D8S1179上為純合子。

圖1 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果

3.2 STR基因座位點等位基因片段定值

細胞樣本HPF和HSSM DNA STR基因座等位基因測序結果表明STR基因座等位基因核心序列均由4個核苷酸組成（圖2和圖3），定值結果顯示由于在基因座上核心序列重復數(shù)目不同，產(chǎn)生了相應的等位基因（表2）。

表2 HPF和HSSM STR基因座等位基因定值結果

4 結束語

DNA是高等生物個體生物信息的遺傳載體，其本質上是由A、G、C、T 4種堿基按照一定序列進行排列組合而成的雙螺旋分子[6]。STR基因座位點核心序列亦是由上述4種堿基中的1種或幾種組成，重復數(shù)目的差異造成了同一位點出現(xiàn)不同的等位基因[7]。本研究利用PCR方法擴增了法醫(yī)DNA標準物質備選所用細胞基因組DNA，分離得到STR位點等位基因單個片段，經(jīng)測序得出每一片段核心序列的重復次數(shù)，依據(jù)國際法醫(yī)遺傳學會（ISFG）于2001年和2005年提出的《基于重復序列數(shù)目的等位基因命名指導原則》并且參照STR基因座的標準序列，最終得到了18個STR基因座的分型，測序定值結果與文中采用的商品化試劑盒分型結果全部一致，從分子水平上對STR分型的等位基因進行了有效的定值。研究同時發(fā)現(xiàn)，在核心重復序列的側翼序列測序結果中，有部分位點與標準參考序列不一致，這為復合擴增試劑盒引物設計提供了參考，在設計擴增這些基因座的引物時應盡量避免出現(xiàn)突變的區(qū)域。

圖2 HPF DNA STR基因座等位基因測序結果

圖3 HSSM DNA STR基因座等位基因測序結果

從測序結果可以看出，法醫(yī)DNA分析中使用的DNA標準物質STR分型定值最終追溯到了DNA組成的分子本質，即4種堿基的排列組合以及這種組合在整個生物進化過程中保存下來的重復數(shù)目的差異性[8]。因此，有理由相信在充分參考DNA分子組成本質的基礎上，建立一套DNA分子的生物學基本國際單位以及相應的定值標準要求，同時結合利用法醫(yī)遺傳學分析方法將法醫(yī)DNA標準物質溯源至基本單位，不僅可以有效解決法醫(yī)DNA標準物質的標準溯源問題，還有利于各個實驗室之間在實際操作中所用不同標準物質間的規(guī)范和統(tǒng)一，具有一定的理論和實踐意義。

[1]Butler J M.Genetics and genomics of core short tandem repeat loci used in human identity testing[J].J Forensic Sci，2006，51（2）：253-265.

[2]Levin B C，Cheng H，Kline M C，et al.A review of the DNA standard reference materials developed by the National Institute of Standards and Technology[J].Fresenius J Anal Chem，2001（370）：213-219.

[3]孫輝，劉冰，高運華．法醫(yī)DNA標準物質及其應用[C]∥胡蘭.法醫(yī)遺傳學進展與應用.北京：群眾出版社，2008：23-25.

[4]全浩，韓永志．標準物質及其應用技術[M].2版.北京：中國標準出版社，2003：543-580.

[5]趙興春，印佳，孫敬，等.美國法庭科學DNA標準物質[J].中國法醫(yī)學雜志，2009，24（4）：263-266.

[6]王鏡巖，朱圣庚，徐長法.生物化學[M].3版.北京：高等教育出版社，2002：71-95.

[7]鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析[M].北京：中國人民公安大學出版社，2002：56-112.

[8]約翰·巴克爾敦.法庭科學DNA證據(jù)的解釋[M].唐暉，焦章平，譯.北京：科學出版社，2010：45-107.