丹參注射液對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化反應的影響

王文斌，舒 慧，任 平

(1.武漢大學研究生院，湖北 武漢 430071;2.咸寧市中心醫(yī)院;3.鄂州大學醫(yī)學院;4.咸寧學院藥學院)

目前，酒精的消費量呈全球性猛增趨勢，ALD性肝病(alcoholic liver disease，ALD)的發(fā)病亦顯著增加，發(fā)病數(shù)僅次于占主要地位的病毒性肝炎［1］。ALD是因長期、大量飲用各種含乙醇的飲料所致的肝臟損害性病變，加之酒精中毒對神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)的影響，使它已成為一種嚴重危害人們健康的疾病。另外，ALD又常和乙型/丙型肝炎合并存在，起到迭加的致病作用，更易并發(fā)肝硬化及肝癌。因此，對ALD的防治應予以高度重視，加強對ALD的宣傳和防治研究成為當前面臨的重要課題。目前治療上還是以戒酒、營養(yǎng)支持為主，其他試用藥物不甚理想，特別是西藥，未有突破性進展，故在ALD的防治方面以中成藥為主［2］。丹參(Sal via milt ior rhiz a Bunge)是一種常用中藥，有活血化瘀、安神寧心、抗氧化等功效，其臨床應用范圍廣泛［3］。目前有文獻報道丹參對酒精所致的肝損傷同樣具有改善作用，但機制不甚明了，本研究對其改善作用的可能機制進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

丹參注射液(四川升和制藥有限公司產(chǎn)品，15g生藥/ml，每支 10ml)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號20100313)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒(批號 20100516)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒(批號20100528)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)(批號20100421)均購自南京建成生物工程研究所，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

722型光柵分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);3-30K高速臺式冷凍型離心機(德國sigma 公司 );分析天平(A＆D.Company.L imited.Tokyo.Japan)。

1.3 動物造模與分組

60只健康昆明雄性小鼠按體質(zhì)量隨機分成正常對照組、模型對照組、丹參注射液低劑量組(10g·kg-1·d-1)、丹參注射液高劑量組(20g·kg-1·d-1)，每組15只。正常對照組和模型對照組均給予生理鹽水，各組動物每日腹腔注射1次，容積均為0.2ml·10g-1體質(zhì)量，連續(xù)10d。末次給藥后禁食12h，除正常對照組外，其余各組按12ml· kg－1體質(zhì)量灌胃給予50%乙醇造成急性酒精肝損傷模型。

1.4 觀察指標

灌胃給予酒精后禁食不禁水，8h后稱體質(zhì)量，并且摘眼球取血，3500r/min離心15min，取血清備測ALT、AST。迅速剖取肝臟稱重，計算肝指數(shù)(肝指數(shù)=肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)。4℃生理鹽水沖洗，在肝臟左葉距邊緣0.5cm處剪一小塊肝組織置于10%甲醇溶液固定，備做病理切片，取相同部位肝臟0.5g加生理鹽水制成10%勻漿液，備測肝組織 MDA、GSH-Px。

1.5 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用表達，兩組間采用兩獨立樣本的t檢驗;顯著性檢驗以0.05和0.01為標準。

2 結果

2.1 一般情況、死亡率與肝指數(shù)

正常對照組小鼠基礎狀態(tài)良好。模型組小鼠基礎狀態(tài)變差，毛色干枯無光澤，活動減少，有些小鼠出現(xiàn)稀便現(xiàn)象，共死亡5只小鼠。低劑量組小鼠死亡4只，高劑量組死亡2只。丹參注射液低、高劑量組肝指數(shù)較模型組明顯減低(P＜0.01或P＜0.05)。各組小鼠死亡率、肝指數(shù)比較結果見表1。

表1 各組小鼠死亡率、肝指數(shù)的變化

2.2 丹參注射液對急性酒精性肝損傷小鼠血清肝功能的影響

從表2可見，與正常對照組比較，模型組血清中ALT、AST活性顯著增高，差異有顯著性(均為P＜0.01)，說明造模成功。與模型組比較，丹參注射液低高劑量組可降低血清ALT、AST活性，兩者差異有顯著性(P＜0.01或 P＜0.05)。

表2 丹參注射液對急性酒精性肝損傷小鼠血清肝功能的影響()

表2 丹參注射液對急性酒精性肝損傷小鼠血清肝功能的影響()

與模型組比較，*P＜0.05、＊ ＊ P＜0.01;與正常組比較，△P＜0.01

組別 例數(shù) ALT(U/L) AST(U/L)15 39.19 ±17.02 60.48 ±6.58模型組 10 95.96±28.41△ 156.41±12.93△丹參注射液低劑量組 11 69.01±17.77＊＊ 72.82±19.31*丹參注射液高劑量組 13 49.90±17.87＊＊ 60.00±6.56正常對照組＊＊

2.3 丹參注射液對酒精性肝損傷小鼠肝勻漿中MDA、GSH-Px的影響

表3可見，與正常對照組比較，模型組小鼠肝勻漿中MDA含量較高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與模型組比較，丹參注射液肝勻漿中MDA含量均較低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。與正常對照組比較，模型組小鼠肝勻漿GSH-Px活力較低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，與模型組比較，丹參注射液低高劑量組小鼠肝勻漿GSH-Px活力均較高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，丹參注射液低高劑量組可顯著升高急性酒精性肝損傷小鼠肝勻漿GSH-Px水平(P＜0.01)，與對照組比較無差異(P ＞0.05)。

表3 丹參注射液對小鼠肝組織GSH-Px、MDA的影響()

表3 丹參注射液對小鼠肝組織GSH-Px、MDA的影響()

與模型組比較，*P＜0.05、＊＊ P＜0.01;與正常組比較，△P＜0.01

組別 例數(shù)GSH-Px(mgGSH/gprot)MDA(nmol/mgprot)15 291.67 ±19.65 2.12 ±0.23模型組 10 191.41±9.55△ 4.14±1.14△丹參注射液低劑量組 11 209.97±14.25＊＊ 3.03±0.634*丹參注射液高劑量組 13 258.18±14.86＊＊ 2.53±0.6正常對照組＊＊

2.4 各組小鼠肝組織病理變化比較

各組小鼠肝組織經(jīng)石蠟切片，HE染色后在顯微鏡下觀察，結果如圖1所示。正常對照組肝小葉輪廓清晰，肝索排列整齊圍繞中央靜脈呈放射狀，肝竇清晰可見，匯管區(qū)未見炎性細胞浸潤;模型組肝細胞高度水腫，并可見氣球樣變，肝竇受壓，可見血管充血和灶性壞死，部分區(qū)域伴炎性細胞浸潤;丹參注射液低劑量組肝臟結構大致正常，肝細胞中度水腫，壞死不明顯，可見炎性細胞浸潤;丹參注射液高劑量組小葉結構基本正常，細胞輕度水腫，未見纖維化、脂肪變性及壞死。

圖1 丹參注射液對小鼠臟組織病理學的影響(HE×400)

3 討論

ALD是由長期大量飲酒所致的肝臟疾病。已知乙醇進入肝細胞以后，經(jīng)過肝乙醇脫氫酶、過氧化氫體分解酶和肝微粒體乙醇氧化酶系3條途徑氧化為乙醛。這個過程中可產(chǎn)生大量自由基，過量的自由基導致肝細胞及胞內(nèi)膜結構中多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，形成脂質(zhì)過氧化物如MDA等，導致更多脂類分解產(chǎn)物的形成，引起肝細胞損傷。MDA既能反映人體內(nèi)氧化反應水平，也可作為損傷因子損傷人體，故MDA含量可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷程度。脂質(zhì)過氧化作用將活性氧轉化為活性化學劑，通過鏈式或鏈式支鏈反應放大活性氧的作用［4，5］，同時由于活性氧積聚，使肝組織的抗氧化物質(zhì)消耗增加，超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平下降，并且乙醛本身能與GSH-Px的巰基以及抗氧化酶蛋白結合，使GSH-Px水平下降，而且肝功能異常、肝代謝紊亂、脂肪在肝細胞中沉積，進一步使得肝組織廣泛脂肪樣和空泡樣變性，血清中甘油三脂也明顯升高，最終肝細胞廣泛壞死、腫脹死亡［6，7］。本實驗模型組小鼠肝指數(shù)和血清ALT、AST活性明顯升高，肝組織中MDA含量也有顯著性增加，故可認為該急性酒精性肝損傷模型的制備是成功的。

丹參作為一種“活血化瘀藥”在臨床上主要用以治療心血管系統(tǒng)疾病，在肝硬化、肝癌的輔助治療也可見報道［8］。丹參具有良好的保護肝細胞免受損傷、促進肝細胞再生的作用［9］。丹參注射液主要有效成分是水溶性的丹參總酚酸，具有抗脂質(zhì)過氧化的作用。本實驗結果顯示模型組小鼠肝內(nèi)的GSH-Px活性顯著低于正常對照組，MDA含量顯著高于正常對照組，表明肝臟損傷時肝內(nèi)抗氧化反應酶活性減低，脂質(zhì)過氧化反應增強。我們采用不同劑量的丹參注射液給藥，結果發(fā)現(xiàn)丹參注射液低、高劑量組的肝指數(shù)比模型組降低，血清ALT、AST也明顯降低，肝臟病理學檢查顯示肝細胞壞死比模型組明顯好轉，同時丹參注射液低、高劑量組MDA含量明顯降低，GSH-Px活性明顯提高，提示丹參注射液對小鼠的酒精性肝損傷有一定的保護作用。其機制可能與減輕酒精對肝臟的脂質(zhì)過氧化損傷反應，保護肝細胞的結構和功能，減少對肝組織細胞的損害作用，從而抑制酒精的肝毒性反應有關。

［1］凌奇荷，卿篤信.重視對酒精性肝病的研究［J］.中華消化雜志，2001，21(9):517

［2］方志明，陳小囡.丹參注射液對酒精性肝損傷大鼠血清IL-6水平的影響［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2005，4:72

［3］楊衛(wèi)東，朱鴻良，趙保路，等.丹參的氧自由基清除作用［J］.中國藥理學通報，1990，6(2):118

［4］Kim SJ，Lee JW，Jung YS，et al.Ethanolinduced liver injury and changes in sulfur amino acid metabolo mics in glutat hione perox idase and catalase doubleknockout mice［J］.J H ePatol，2009，50(6):1184

［5］Beier JI，Luy endyk JP，Guo L，et al.Fibrin accumulation plays a critical role in the sensitization to lipopolysaccharide induced liver injury caused by ethanol in mice［J］.Hepatology，2009，49(5):1545

［6］鄧源，班春林，武曉瓊.乙醇誘導肝損傷作用機制的研究進展［J］.華北國防醫(yī)藥，2005，17(4):242

［7］楊明杰，周建嫦，黃俊明，等.酒精性肝病發(fā)生機制研究進展［J］.中國公共衛(wèi)生，2003，19(3):367

［8］方文賢，宋崇順，周立孝.醫(yī)用中藥藥理學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1998:899

［9］鄧和軍.丹參護肝機理研究［J］.中國中藥雜志，1992，17(4):233