干酪乳桿菌KLDS1.0381高密度培養(yǎng)條件研究

馬宏慧，孔保華，夏秀芳，李沛軍

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱 150030）

氰干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）屬于乳桿菌屬（Lactobacillus），革蘭氏陽性，不產(chǎn)芽孢，無鞭毛，不運動，兼性厭氧菌，化能異養(yǎng)型微生物，異型發(fā)酵乳糖，不液化明膠，接觸酶陰性，最適生長溫度為37℃，G+C含量為45.6%～47.2%[1]；菌體長短不一，兩端方形，常成鏈；菌落粗糙，灰白色，有時呈微黃色，能利用葡萄糖等多種碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)乳酸[2]，產(chǎn)酸率相對高，但其營養(yǎng)要求復雜，生長繁殖時需要多種氨基酸、維生素和無機鹽等[3]。

干酪乳桿菌是衛(wèi)生部2001年公布的益生菌之一，也是發(fā)酵肉制品中十分重要的菌種。在肉制品中添加干酪乳桿菌后，干酪乳桿菌大量繁殖成為優(yōu)勢菌群，生成乳酸，可使肉制品pH迅速下降[4]，并通過產(chǎn)生乳酸鏈球菌素[5]有效抑制腐敗菌和致病菌的生長和繁殖，如李斯特菌、金黃色葡萄球菌等[6-7]；乳酸菌將肉中的糖原或添加的糖轉換為酸，使肉中鹽溶蛋白質(zhì)從溶膠態(tài)變?yōu)槟z態(tài)，有利于形成良好的組織狀態(tài)[8]；同時乳酸菌能夠分解蛋白質(zhì)生成氨基酸，賦予產(chǎn)品良好的風味[9]。目前國內(nèi)外對益生菌的研究多集中在雙歧桿菌、嗜熱乳桿菌、保加利亞鏈球菌和植物乳桿菌等菌種，對于其他益生菌特別是對于可用于發(fā)酵肉制品的干酪乳桿菌的報道還不多，劉冬梅等人利用8%番茄汁、6%胡蘿卜汁、0.04%抗壞血酸以及與MRS培養(yǎng)基相比2.5倍的氮源的增菌培養(yǎng)基使干酪乳桿菌活菌數(shù)達109cfu·mL-1[10]，陳衛(wèi)等對一株具有降膽固醇作用的干酪乳桿菌的增殖培養(yǎng)基進行了篩選和優(yōu)化，所得培養(yǎng)基中最大菌數(shù)可達8.8×109cfu·mL-1[11]，本文中，通過對增菌培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，可使培養(yǎng)后干酪乳桿菌活菌密度達1010cfu·mL-1以上。

直投式乳酸菌發(fā)酵劑具有活菌含量高、接種量少、發(fā)酵活力強、保藏期長、使用方便等特點，可使發(fā)酵制品生產(chǎn)更方便、產(chǎn)品質(zhì)量更穩(wěn)定[12-13]，并避免了傳統(tǒng)發(fā)酵劑因中間繼代培養(yǎng)（包括菌種活化、種子發(fā)酵劑、中間發(fā)酵劑、生產(chǎn)發(fā)酵劑的擴大增殖等過程）而產(chǎn)生菌種發(fā)酵活力退化和雜菌污染等情況[14]。

直投式發(fā)酵劑可直接向專業(yè)生產(chǎn)廠家生產(chǎn)購買，減少了菌種車間的投資，簡化了工藝，提高了勞動生產(chǎn)率。直投式發(fā)酵劑的制備需使乳酸菌達到高密度培養(yǎng)，本文優(yōu)化了干酪乳桿菌的培養(yǎng)基配方，并對其培養(yǎng)條件和高密度培養(yǎng)物富集條件進行了研究，旨在提高培養(yǎng)物中干酪乳桿菌活菌密度，為進一步利用其制備直投式肉制品發(fā)酵劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種及來源

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）KLDS1.0381，由東北農(nóng)業(yè)大學食品學院乳品科學教育部重點實驗室分離鑒定并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

① 麥芽汁（Malt extract medium，MA）培養(yǎng)基：作為基礎培養(yǎng)基用于干酪乳桿菌的增殖培養(yǎng)。

②MRS（Man rogosa and sharp）培養(yǎng)基：用于干酪乳桿菌的活化、傳代。

③平板計數(shù)培養(yǎng)基：MRS瓊脂培養(yǎng)基。用于干酪乳桿菌的平板活菌計數(shù)。

1.1.3 營養(yǎng)因子

西紅柿、香菇、平菇、胡蘿卜均為市售優(yōu)質(zhì)品。分別取新鮮西紅柿、胡蘿卜、香菇和平菇500 g洗凈后切碎，加適量蒸餾水煮沸30 min，冷卻后于組織搗碎機中搗碎、過濾，濾液經(jīng)離心后加蒸餾水補足至500 mL，分別得到西紅柿汁、胡蘿卜汁、香菇汁和平菇汁。

試驗用葡萄糖、蔗糖、乳糖、糊精、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白、磷酸二氫鉀、檸檬酸三銨、牛肉膏、酵母膏、吐溫80、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳等均為生化試劑或分析純。

1.2 儀器設備

DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；SPX-250B-D型振蕩培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；ZHJH-1109B超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；DELTA 320 pH計（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；Allegra 64R臺式高速冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

菌種活化：將保藏的菌種接種于MRS培養(yǎng)基斜面，37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落，然后再從斜面上挑取菌苔接入另一個斜面，出現(xiàn)菌落后，重復上面操作，連續(xù)轉接3次，既得活化菌種（菌濃度為108～109cfu·mL-1）[15]。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：根據(jù)本試驗室前期試驗結果，確定干酪乳桿菌培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度37℃，搖床轉數(shù)130 r·min-1，培養(yǎng)時間12 h[15]。

活菌計數(shù)：根據(jù)Heenan和賈士芳等[16-17]的方法稍有改動，將待測樣品按10倍梯度系列稀釋，取0.1 mL各稀釋度的菌液，滴加到MRS平板計數(shù)培養(yǎng)基的表面，均勻涂布后置于37℃培養(yǎng)48 h，每1稀釋度重復3皿，計數(shù)發(fā)酵液活菌數(shù)（cfu·mL-1）。

1.3.2 試驗設計

1.3.2.1 單因素影響試驗（60%～100%）的優(yōu)化培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h后測定發(fā)酵液中的活菌含量，以確定最佳搖瓶裝液量。

④離心條件：在0～4℃條件下，根據(jù)不同離心轉數(shù)（4 000～7 500·min-1）、離心時間（10～30 min）設計6組離心條件對培養(yǎng)物進行高密度濃縮，測定每組離心前后的活菌數(shù)和培養(yǎng)物重量，計算離心存活率和濃縮倍數(shù)，以確定最佳離心條件。

1.3.2.2 正交試驗

將乳糖添加量、胰蛋白胨添加量、西紅柿汁添加量、牛肉膏添加量選用4因素3水平的L9（34）正交進行優(yōu)化試驗，正交試驗因素及其水平見表1。

試驗共9個組合，各組合設3次重復[18]。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factor and level of orthogonal experimental design (%)

1.4 統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)為3次重復試驗的平均值。所得數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Statistix 8.1軟件包中Linear Models程序進行，差異顯著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD程序。

2 結果與分析

2.1 菌體增殖因子的篩選

以MRS培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成為依據(jù)，參考相關文獻，選取干酪乳桿菌的營養(yǎng)因子分別添加于麥芽汁培養(yǎng)基中，配制成多種生長培養(yǎng)基。分別接種活化好的干酪乳桿菌，37℃恒溫培養(yǎng)12 h，檢測菌懸液活菌數(shù)，測定pH，觀察每種營養(yǎng)因子對干酪乳桿菌的增菌效果。添加的營養(yǎng)因子種類、添加量及增菌效果見表2。

表2結果表明，干酪乳桿菌在本試驗中所用的20種培養(yǎng)基中均可正常生長并進行代謝產(chǎn)酸。添加乳糖、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、西紅柿汁和平菇汁的麥芽汁培養(yǎng)基中，干酪乳桿菌增菌效果較添加其他單因子的增菌效果顯著（P＜0.05），可以推斷，乳糖是干酪乳桿菌生長的良好碳源[19]，胰蛋白胨是干酪乳桿菌生長的良好氮源[11]，西紅柿汁和平菇汁不僅能為干酪乳桿菌生長提供氮源，而且還能提供干酪乳桿菌生長所必須的核苷酸、維生素和礦物質(zhì)元素等營養(yǎng)成分[20]，酵母膏和牛肉膏為干酪乳桿菌提供氨基酸及維生素等營養(yǎng)成分[11,19]；添加緩沖鹽的麥芽汁培養(yǎng)基中，增菌效果較其他組增菌效果不顯著（P＜0.05），這可能是因為麥芽汁培養(yǎng)基中已含有大量緩沖鹽成分，在發(fā)酵培養(yǎng)時可以中和干酪乳桿菌代謝過程中產(chǎn)生的大量乳酸，解除了產(chǎn)物乳酸對菌體生長的抑制作用[20]；考慮到同源組內(nèi)存在較小差異及經(jīng)濟成本因素，本試驗選取乳糖、胰蛋白胨、牛肉膏和西紅柿汁為干酪乳桿菌的增殖培養(yǎng)因子。

2.2 增殖培養(yǎng)基配方的確定

考慮到幾種增殖因子之間可能存在聯(lián)合協(xié)同的交互作用，因而對在單因素試驗中增菌效果較明顯的四種增殖因子（乳糖、胰蛋白胨、西紅柿汁及牛肉膏）采用L9（34）正交試驗，優(yōu)化干酪乳桿菌的最佳增菌培養(yǎng)基，結果見表3。

表2 干酪乳桿菌在添加不同營養(yǎng)因子的麥芽汁培養(yǎng)基中的菌體生長Table 2 Living cell count of Lactobacillus casei in malt extract medium with different nutritional factor

表3 正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal experiment

表3結果表明，四個因素中，對干酪乳桿菌活菌增殖量的影響順序為B＞C＞D＞A，說明影響干酪乳桿菌生長增殖的最主要的因素是胰蛋白胨,其他三個因素依次是西紅柿汁、牛肉膏和乳糖，其中西紅柿汁和牛肉膏兩因素對干酪乳桿菌的增菌效果差異較小，而碳源對增菌作用不顯著[10]，說明氮源是干酪乳桿菌生長的主要因素，氮源含量高的培養(yǎng)液中干酪乳桿菌增殖迅速，這與金樁、劉冬梅等研究結果[10,21]較為一致，因此確定最佳增殖培養(yǎng)基配比為A2B3C3D3，即1%乳糖、2%胰蛋白胨、20%西紅柿汁和0.2%牛肉膏，在37℃培養(yǎng)12 h后，干酪乳桿菌活菌密度可達到1×1010cfu·mL-1以上。

2.3 初始pH對菌體增長的影響

由于搖瓶發(fā)酵過程中pH難以控制，因此本試驗采用控制液體培養(yǎng)基初始pH達到最佳增菌效果。將培養(yǎng)基初始pH調(diào)至5.5、6.0、6.5、7.0和7.5，分別接種活化好的干酪乳桿菌，37℃恒溫培養(yǎng)12 h，檢測菌懸液活菌數(shù)，不同初始pH的增菌效果見圖1（圖1中左邊縱軸表示0 h時培養(yǎng)基中干酪乳桿菌活菌數(shù)，圖右邊縱軸表示培養(yǎng)12 h后培養(yǎng)基中干酪乳桿菌活菌數(shù)）。

圖1 初始pH對菌體增長的影響Fig.1 Effect of pH on strain concentration

圖1結果表明，培養(yǎng)基初始pH對干酪乳桿菌菌體增長情況影響較大。干酪乳桿菌在以上5種培養(yǎng)基中均能正常生長代謝，但培養(yǎng)基初始pH為7.0的組增菌效果優(yōu)于其他組，差異顯著（P＜0.05），初始pH高于或低于7.0的培養(yǎng)基中，增菌效果均不理想。這是因為，每種微生物都有自身生長的適宜pH范圍，當環(huán)境中的氫離子濃度超出了微生物的適應范圍，就會降低或抑制微生物的生命活動[22]。在發(fā)酵過程中，乳酸菌利用碳源、氮源等生長物質(zhì)產(chǎn)生乳酸，隨著乳酸的積累、培養(yǎng)液中pH的降低，會對乳酸菌自身造成酸損傷[11,23]，隨著培養(yǎng)時間的延長、菌數(shù)的增加，可導致培養(yǎng)液pH的持續(xù)下降，在pH降至4.0左右時，就會抑制菌株的再次分裂增殖，如果pH再繼續(xù)下降，則進入衰亡期，乳酸菌細胞自身的酶類水解細胞壁肽聚糖的網(wǎng)絡結構，造成菌株活力減弱，最后導致菌體細胞裂解死亡[24-25]，這種現(xiàn)象被稱為乳酸菌的“自溶”。因此，培養(yǎng)基初始pH較高的組增菌效果要優(yōu)于初始pH低的組。綜合考慮兩方面因素，故本試驗選取干酪乳桿菌培養(yǎng)基初始pH為7.0。

2.4 搖瓶裝液量對菌體增長的影響

將優(yōu)化培養(yǎng)基按60%、70%、80%、90%及100%的裝液量分別裝于500 mL三角瓶中，接種活化好的干酪乳桿菌，37℃恒溫培養(yǎng)12 h，檢測菌懸液活菌數(shù)，不同搖瓶裝液量的增菌效果見表4。

表4 不同搖瓶裝液量對菌體增長的影響結果Table 4 Effect of different quantity of medium on strain concentration

表4結果表明，搖瓶裝液量對干酪乳桿菌菌體增長情況影響較大，其中裝液量為100%（500 mL/500 mL）的組較其他組增菌效果明顯，差異顯著（P＜0.05），這可能是因為干酪乳桿菌為兼性厭氧菌，雖耐氧但并不好氧，裝液量的多少會影響液體培養(yǎng)基中的溶氧量，對大多數(shù)微生物來說，溶氧是進行能量代謝最重要的氣相底物，并且通常是發(fā)酵的限制性因素，培養(yǎng)基的供氧情況影響氧化還原電位值，不同的氧化還原電位值有可能使干酪乳桿菌的代謝途徑發(fā)生改變，從而影響菌體的生長與產(chǎn)物的形成[26]。因此，過多的溶氧量不利于菌體生長增殖，通過試驗可以得出100%（500 mL/500 mL）為干酪乳桿菌的最佳搖瓶裝液量。

2.5 離心條件對干酪乳桿菌菌體濃縮效果的影響

本試驗共設6組離心條件對干酪乳桿菌進行高密度富集，離心后活菌存活率及濃縮效果如表6所示。

離心后菌泥中干酪乳桿菌活菌密度（cfu·g-1）=離心后活菌總數(shù)（cfu）/離心后菌泥總重量（g）

菌體富集時，選擇恰當?shù)碾x心參數(shù)（離心轉數(shù)、離心時間）是尤為必要。如表5所示，離心富集乳酸桿菌菌體時，低轉速離心相比較于高轉速離心，菌體存活率高且差異顯著（P＜0.05），相同離心轉數(shù)下，短時間離心比長時間離心，菌體存活率高且差異顯著（P＜0.05），這是因為相同條件下，離心轉數(shù)越高，離心時間越長，對菌體的機械損傷越大，離心后菌體存活率越低[22-23]。同時，離心轉數(shù)的高低和離心時間的長短決定了菌體富集是否完全，低轉數(shù)、短時間離心雖有利于提高菌體存活率，卻會使菌體富集不完全，導致部分菌株還存在于上清液中，達不到期望的濃縮效果[22-23,27]，綜合考慮以上兩個方面和實際成本以及對離心機的使用維護，本試驗采用4 000 r·min-1,30 min作為干酪乳桿菌菌體富集的離心條件，離心后，菌泥中干酪乳桿菌活菌密度可達8.62×1011cfu·mL-1。

3 結論

本試驗以麥芽汁培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，通過單因素和正交試驗確定出干酪乳桿菌高密度增殖培養(yǎng)條件。試驗結果表明：適合干酪乳桿菌生長的最佳碳源、氮源及營養(yǎng)因子分別為乳糖、胰蛋白胨、西紅柿汁和牛肉膏。通過L9（34）正交試驗優(yōu)化出干酪乳桿菌最佳增殖培養(yǎng)基配比為：1%乳糖、2%胰蛋白胨、20%西紅柿汁和0.2%牛肉膏。極差分析表明其中氮源（胰蛋白胨）是影響干酪乳桿菌生長增殖的最主要的因素。干酪乳桿菌的最佳高密度培養(yǎng)和富集條件為搖瓶裝液量500 mL/500 mL，初始pH為7.0，增殖培養(yǎng)后菌液經(jīng)4 000 r·min-1離心30 min后，菌泥中活菌密度可達到8.62×1011cfu·g-1，這為下一步凍干制備直投式發(fā)酵劑奠定了基礎。

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