體外培養(yǎng)過程中軟骨細胞凋亡與Caspase－3基因表達的關系

西安醫(yī)學院組織胚胎學教研室（西安710021）

吳志新 胡春燕＊ 王 蘭 鄭慧媛 趙 璇 崔媛媛 石明娟

研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞在體外培養(yǎng)、擴增、低溫凍存、復蘇等過程中都有不同程度的細胞凋亡發(fā)生。細胞凋亡是由基因調控的細胞自主性死亡過程，細胞內發(fā)生的與凋亡有關的一系列有序的級聯(lián)反應都與一組成為Caspase的蛋白酶家族有關，這些酶參與了凋亡前導信號的觸發(fā)、底物的降解和細胞的裂解［1］。Caspases蛋白酶家族具有相似的氨基酸序列、結構和相似的作用底物特異性。Caspase－3是許多哺乳動物細胞凋亡級聯(lián)反應時下游的關鍵蛋白酶，是凋亡的主要執(zhí)行者［2，3］。通過對軟骨種子細胞凋亡時Caspase－3表達水平的觀察，就能判斷體外培養(yǎng)軟骨細胞時組織凋亡發(fā)生的分子靶點。

材料與方法

1 實驗材料 Caspase－3蛋白酶活性檢測試劑盒（Apo Alert R Caspase－3Colorimetric Assay Kit）購自Clontech公司；TUNEL檢測試劑盒（TACSTMTdT Kit）購自 R＆D System 公司；TNF－α和 Cycloheximide（CHX）購自深圳晶美公司；F－12細胞培養(yǎng)基、胰酶、MTT、胎牛血清、臺盼藍購自Sigma公司；軟骨細胞取自自愿捐獻的意外流產(chǎn)胎兒（胎齡3～5個月），由陜西省婦幼保健院婦產(chǎn)科提供提供。

2 檢測方法

2.1 體外培養(yǎng)軟骨細胞的誘導凋亡及檢測

2.1.1 軟骨細胞培養(yǎng)：常規(guī)無菌取材，原代培養(yǎng)。將活力達到90%以上的細胞懸液按細胞密度1.5×106個細胞／100mm培養(yǎng)皿的密度接種（原代及第1、2代細胞按此密度接種1周內可長滿培養(yǎng)皿），置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細胞生長，每周換液兩次。2.5g／L 胰酶＋1mmol EDTA（pH7.2）消化傳代。另用 Masson染色，觀察細胞形態(tài)和細胞內蛋白聚糖，進行軟骨細胞鑒定。

2.1.2 誘導軟骨細胞凋亡：選擇 TNF－α＋Cycloheximide（CHX）作為刺激因子誘導細胞凋亡。細胞傳代后以2.0×105密度接種6孔板，培養(yǎng)24h，分別加入不同濃度的TNF－α和CHX處理細胞。每組設3個復孔。24h后進行細胞凋亡檢測，以選擇合適的濃度最有效地誘導軟骨細胞發(fā)生凋亡?？瞻讓φ战M選擇同樣培養(yǎng)條件的軟骨細胞，同期不進行凋亡誘導。

2.1.3 TUNEL法檢測：①載玻片的處理及細胞生長：用0.1mol／L HCl沖洗玻片20min，無水乙醇淋洗，自然干燥，浸入3×SSC、0.02%Ficoll和0.02%聚乙烯吡咯烷酮中65℃溫育2h，用乙醇／乙酸（3∶1）固定20min，干燥后高壓滅菌。處理好的玻片放入培養(yǎng)皿中，接種細胞制備細胞爬片，培養(yǎng)條件和時間見上。②凋亡細胞形態(tài)學觀察和檢測：按試劑盒提供的說明書進行操作：取各組細胞爬片，光鏡下觀察，細胞核呈棕褐色者為陽性細胞，每組取3張玻片，每張玻片隨機選取3個視野（×400）計數(shù)陽性細胞和細胞總數(shù)，按下列公式計算凋亡指數(shù)（Apoptotic index，AI）：AI＝ （陽性細胞數(shù)／細胞總數(shù)）×100%。

2.2 RT－PCR 測 定 Caspase－3mRNA 的表達采用TRIZOL法提取細胞總RNA，紫外分光光度儀測定總RNA的濃度和純度，－80°C凍存?zhèn)溆谩CR引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列如下：Caspase－3為 5’－GGCATGGAGAACACTGAAAAC－3 ’； 5 ’－GCGAATCTGTTTCTTTGCATG－3 ’（786bp）；內參照β－actin 5’－ATCATGTTTGAGACCTTCAA－3’；5’－CATCTCTTGCTCGAAGTCCA－3’（310bp）。按照一步法RT－PCR試劑盒說明書進行操作，反應條件如下：50°C 1h，94°C 5min，94°C變性30 s，65°C退火30s，68°C延伸1min，進行35個循環(huán)，最后68°C延伸2min。擴增產(chǎn)物各取5μl，經(jīng)12g／L瓊脂糖凝膠電泳后，天能GIS凝膠圖象處理系統(tǒng)攝影，相應的PCR分析軟件對Caspase－3mRNA含量進行半定量分析。

2.3 細胞內Caspase－3蛋白活性檢測 應用比色法分 析 Caspase－3蛋 白 活 性，按 Apo Alert R Caspase－3Colorimetric Assay Kit說明書進行操作。收集第0、1、4和8代、培養(yǎng)第3天和第7天的細胞，測定Caspase－3蛋白酶活性。取2.0×106個細胞，1 000 r／min離心10min，棄上清液。用預冷的50μl細胞裂解液懸浮細胞，冰上孵育10min。于15 000r／min，4℃離心15min，將上清液轉移至另一個無菌EP離心管中，加入50μl 2×Reaction Buffer／DTT Mix及5μl 1mmol／L的 Caspase－3底物（DEVD－p NA），37℃水浴1h。選擇405nm波長，比色法分析Caspase－3蛋白酶活性。每個時間點設3個復孔，取平均值。

3 統(tǒng)計學處理 本組數(shù)據(jù)均采用SPPSS15.0版本進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t檢驗，以P＜0.05為有顯著性差異，以P＜0.01為有極顯著性差異。

結 果

1 體外培養(yǎng)軟骨細胞誘導凋亡及檢測結果 見附表。按常規(guī)機械酶消化法分離的胚胎關節(jié)軟骨細胞，臺盼藍拒染試驗表明細胞活力為（93.4±6.2）%。細胞呈貼壁單層生長，早期為多邊形，體積較小，隨傳代體積逐漸增大。軟骨細胞在刺激因子TNF－α和CHX作用下均發(fā)生凋亡。不同濃度的刺激因子作用24h后，分別用AnnexinV－FITC標記、流式細胞術法（FCM）和TUNEL法對各組細胞的凋亡指數(shù)進行分析。TNF－α的致凋亡作用明顯強于CHX，但是TNF－α的濃度在30ng／ml以上時，培養(yǎng)皿中出現(xiàn)漂浮細胞，F(xiàn)CM檢測壞死細胞增多。TUNEL法染色顯示爬片上凋亡細胞核染成棕色。對照組僅見少數(shù)凋亡細胞，而不同濃度TNF－α＋CHX組凋亡軟骨細胞明顯增多。計數(shù)陽性細胞，統(tǒng)計結果與FCM的結果相似。為了選擇合適的TNF－α＋CHX濃度使軟骨細胞凋亡發(fā)生率在30%～50%，最后選定 TNF－α（30ng／ml）＋CHX（1.0μg／ml）組作為后續(xù)試驗的凋亡誘導條件。

2 Caspase－3mRNA的表達 見圖1。RT－PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)過程中，軟骨細胞內均有Caspase－3mR－NA表達，并且隨著培養(yǎng)時間的延長，各代細胞的Caspase－3mRNA 的相對表達量逐漸增加。Caspase－3 mRNA的相對表達量與軟骨細胞的凋亡程度基本一致。

附表 不同濃度TNF－α＋CHX作用下軟骨細胞凋亡指數(shù)（%）

圖1 Caspase－3mRNA在軟骨細胞體外培養(yǎng)過程中的表達（RT－PCR）

3 Caspase－3蛋白酶活性的檢測 見圖2。為評價軟骨細胞s在體外培養(yǎng)過程中Caspase－3蛋白酶活性的變化，應用比色法檢測了第0、1、4和8代細胞培養(yǎng)第3天和第7天的Caspase－3蛋白酶活性。隨著培養(yǎng)時間的延長，各代細胞的Caspase－3蛋白酶活性逐漸升高（P＜0.01）。Caspase－3蛋白酶活性與軟骨細胞凋亡程度基本一致。

圖2 軟骨細胞體外培養(yǎng)過程中Caspase－3酶活性的變化

討 論

軟骨細胞在生長、發(fā)育、老化等生理過程中及疾病狀態(tài)下（如骨關節(jié)炎、類風濕病、損傷等）的病理過程都存在凋亡現(xiàn)象［4、5］，我們用不同濃度的 TNF－α＋CHX體外誘導軟骨細胞凋亡，TUNEL染色、流式細胞術證實軟骨細胞出現(xiàn)了凋亡的特征性改變。Caspase－3的mRNA與蛋白酶活性檢測顯示軟骨細胞凋亡過程中Caspase－3表達上升，蛋白酶活性明顯增高，且活性增高的程度與細胞凋亡的程度相一致。Nuttall等［6］的研究也表明應用非特異性的Caspase－3抑制劑ZVAD－FMK和特異性的CPP－32亞家族抑制劑 Ac－DEVD－CHO，均可以抑制多種刺激因子誘導軟骨細胞的凋亡，而特異性的ICE家族抑制劑如Caspase－1抑制因子 Ac－YVAD－CHO，Caspase－8抑制劑 Ac－IETDCHO則不能抑制軟骨細胞的凋亡，提示在軟骨細胞的凋亡過程中，Caspase－3的活化起著關鍵作用，Caspase－3可能是軟骨細胞凋亡途徑中核心成分［7］。

本研究采用TNF－α＋CHX體外誘導軟骨細胞凋亡，觀察到細胞培養(yǎng)過程中凋亡自然發(fā)生和誘導發(fā)生時，細胞內Caspase－3蛋白酶從基因和蛋白表達水平上均有顯著的增加。這為組織工程中軟骨細胞培養(yǎng)產(chǎn)量的提升提供了新的干預靶點。

［1］ 嚴雪港，鮑同柱.骨關節(jié)炎軟骨細胞凋亡研究進展［J］.陜西醫(yī)學雜志，2010，39（3）：354－356.

［2］ Suzuki A，Iwasaki M，Wagai N.Involvement of cytoplasmic serine proteinase and CPP32subfamily in the molecular machinery of Caspase 3activation during Fas－mediated apoptosis［J］.Exp Cell Res，1997 ，233（1）：48－55.

［3］ Porter AG，Janicke RU.Emerging roles of Caspase－3in apoptosis［J］.Cell Death Differ，1999，6（2）：99－104.

［4］ Kim HA，Blanco FJ.Cell death and apoptosis in osteoarthritic cartilage［J］.Curr Drug Targets，2007，8（2）：333－345.

［5］ Pucci B，Adams CS.Development of the terminally differentiated state sensitizes epiphyseal chondrocytes to apoptosis through Caspase－3activation［J］.J Cell Physiol，2007 ，210（3）：609－615.

［6］ Nuttall ME，Nadeau DP.Inhibition of Caspase－3－like activity prevents apoptosis while retaining functionality of human chondrocytes in vitro［J］.J Orthop Res，2000，18（3）：356－363.

［7］ Vrahas MS，Mithoefer K，Joseph D.The long－term effects of articular impaction［J］.Clin Orthop Relat Res，2004 ，423（1）：40－43.