乙型肝炎病毒外膜大蛋白檢測及臨床應用

西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院檢驗科（西安710004）

李妙羨 吳曉康 王香玲 耿 燕 盧 潔 王小利 張 妮 魏雅鳳

乙型肝炎病毒（HBV）為嗜肝DNA病毒，含有3200個核苷酸，其中S基因編碼合成的HBV外膜蛋由3種蛋白組成，包括主蛋白（即HBsAg），中蛋白（即HBsAg和Pre－S2蛋白）和大蛋白（即 HBsAg、Pre－S1蛋白 和 Pre－S2 蛋 白）［1］。大 蛋 白 存 在 于 感 染 顆 粒（Dane顆粒）和亞病毒管狀顆粒上，是病毒形成完整外膜的重要標志，與病毒復制密切相關，對HBV復制過程具有反式激活作用，并與病毒顆粒從細胞內釋放有關，乙肝病毒外膜大蛋白（HBV－LP）在肝細胞內質網(wǎng)積聚是導致內質網(wǎng)應激的關鍵因素，并與肝細胞毒性甚至肝癌相關［2］。近年來隨著對HBV外膜蛋白研究的深入，發(fā)現(xiàn)其有雙重跨膜拓撲結構［3］，這是 HBVLP發(fā)揮多功能作用的依賴性結構。通過其在乙型肝炎發(fā)病機制、感染與病毒復制等方面的研究，使人們逐漸認識到了其越來越重要的臨床意義。筆者檢測了238例 HBV－M 陽性血清中 HBV－LP 、HBV－DNA、Pre－S1－A，并進行了分析，探討其在臨床中的應用。

材料和方法

1 材 料 收集2012年1月至2012年3月西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院門診及住院患者278例，其中 HBV－M 陽性患者血清238例 （HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性65例；HBsAg、HBeAb、HB－cAb陽性116例；HBsAg、HBcAb陽性53例；HB－sAg、HBeAg、4例），男143例，女95例，年齡2～73歲，平均35.3歲；正常對照40例，男18例；女22例，年齡7～63歲，平均40.3歲，GPT、GOP、HBV－M、HBV DNA、HBV－LP及 Pre－S1－Ag均為正常。所有血清標本均于－80℃保存。

2 方 法

2.1 HBV DNA檢測：采用實時熒光定量聚合酶鏈反應技術（PCR）檢測，儀器為美國ABI公司7500型擴增儀，試劑盒（YZB／國0371－2009）購自廣州中山大學達安基因公司，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。HBV DNA陽性判斷標準標準：HBV DNA含量≥103IU／ml為陽性。

2.2 乙型肝炎病毒Pre－S1－Ag檢測：采用酶聯(lián)免疫 （ELISA）技術，試劑 （YZB／國0371－2009）購自上海阿爾法生物技術有限公司，儀器為雷杜6100型酶標儀及3900型洗板機，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。Pre－S1－Ag陽性判斷標準：S／CO≥1為陽性。

2.3 HBV－M檢測：采用酶聯(lián)免疫 （ELISA）技術，試劑盒 （YZB／國0371－2009）購自于北京萬泰生物技術有限公司，儀器為雷杜6100型酶標儀及3900型洗板機，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。HBV－M陽性判斷標準：HBsAg、HBsAb、HBeAg為S／CO≥1為陽性；HBeAb、HBcAb為S／CO≤1為陽性。

2.4 HBV－LP檢測：采用酶聯(lián)免疫 （ELISA）技術，試劑盒 （YZB／國0371－2009）為北京熱景生物技術有限公司贈送，儀器為雷杜6100型酶標儀及3900型洗板機，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。HBV－LP陽性判斷標準：S／CO≥1為陽性。

以上四種試劑均在有效期內并有試劑盒內、外質控（除 HBV－LP）。

3 統(tǒng)計學方法 采用χ2檢驗。

結 果

1 HBV DNA與HBV－LP陽性率比較：HBV DNA與HBV－LP陽性率比較，見表1。238例HBVM陽性患者血清同步檢測HBV DNA和HBV－LP，結果顯示，HBV DNA陽性（＋）174例，陽性率為73.11%（174／238）；HBV－LP陽性（＋）198例，陽性率為83.19%（198／238）。以 HBV DNA 和 HBV－LP為判斷病毒復制指標，有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 HBV DNA與HBV－LP檢測結果

2 Pre－S1－Ag與 HBV－LP陽性率比較：Pre－S1－Ag與HBV－LP陽性率比較，見表2。238例 HBV－M陽性患者血清同步檢測Pre－S1－Ag和 HBV－LP，結果顯示，HBV－LP陽性（＋）198例，陽性率為83.19%（198／238）；Pre－S1－Ag1陽 性 （＋ ）184 例，陽 性 率 為77.31%（184／238）；二者有顯著性差異（P＜0.05）。

表2 Pre－S1－Ag與 HBV－LP檢測結果

3 HBV標志物不同模式HBV DNA與HBV－LP檢出率比較：HBV標志物不同模式HBV DNA與HBV－LP檢出率，見表3。238例HBV－M陽性患者血清同步檢測HBV標志物、HBV DNA和HBV－LP，結果顯示，65例HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性（＋）標本中 HBV DNA，陽性率為95.4%（62／65），HBV－LP陽性率為96.9%（63／65）；116例 HBsAg、HBeAb 、HBcAb陽性（＋）標本中HBV DNA陽性率為67.0%（80／116），HBV－LP陽性率為75.9%（88／116）；4例HBsAg、HBeAg陽性（＋）標本中HBV DNA陽性率為100.0%（4／4），HBV－LP陽性率為100.0%（4／4）；以上三種模式，HBV DNA與HBV－LP的陽性率比較無顯著性差異（P﹥0.05）；53例 HBsAg、HBcAb陽性（＋）標本中 HBV DNA 陽性率為52.8%（28／53），HBV－LP陽性率為84.9%（45／53），二者比較有顯著性差異（P＜0.05）。

4 正常對照40例，GPT、GOP、HBV－M、HBV DNA、Pre－S1－Ag及 HBV－LP檢測均為陰性。

表3 HBV標志物不同模式HBV DNA與HBV－LP檢出率比較

討 論

乙型肝炎具有較強傳染性，且病后發(fā)生肝硬化、肝癌的相對危險度增高［4］，對患者生活、健康等造成嚴重影響，因此如何通過實驗室檢測手段對乙肝的診斷、抗病毒治療、病情進展情況及病毒復制進行監(jiān)測評估是該病防治工作的重要一環(huán)。目前，常以外周血HBV DNA、HBeAg、Pre－S1－Ag作為臨床判斷 HBV病毒復制程度的指標，HBV DNA定量檢測結果也已成為抗病毒治療效果和患者預后判斷的重要依據(jù)。但由于HBV DNA前C區(qū)nt1896位和基本核心啟動子區(qū)（BCP）1762、1764位聯(lián)合突變導致 HBeAg陰性乙型肝炎、以及由核苷類藥物對HBV DNA復制的快速抑制，使患者血清中保留著低水平HBV DNA，加之，在HBV形成包膜的過程中需要大蛋白（即HBsAg、Pre－S1蛋白和Pre－S2蛋白）和中蛋白參與［5］，因此檢測Pre－S蛋白的存在對于判斷HBV復制具有一定的意義。以往檢測是通過檢測大蛋白的獨有片斷Pre－S1蛋白來實現(xiàn)的［6］，但是編碼 Pre－S蛋白的 HBV－LP Pre－S區(qū)具有較復雜的雙重拓撲結構［3］，導致 Pre－S1－Ag的檢出率低［7，8］不能很好反映HBV的復制情況。基于以上原因，可能造成假陰性結果，該研究也證明了這一點，近年來國內外關于乙型肝炎病毒包膜蛋白結構的大量研究證明，HBV－LP主要存在于不含核酸的亞病毒顆粒以及完整的乙型肝炎病毒顆粒，且與乙型肝炎病毒的復制有著密切的關系，能在一定程度上反映乙型肝炎病毒復制情況［9］，病毒復制期HBV－LP大量滯留在肝細胞中，對肝細胞有直接的毒性作用，且對HBV復制的過程具有反式激活作用，并與病毒顆粒從細胞內釋放調節(jié)有關［2］，有研究表明在治療應答過程中HBV－LP比HBV DNA陰轉大約5個月，在不同的個體可能時間不一樣［10］，所以 HBV－LP的檢測對乙型肝炎的診斷、治療效果的觀察以及是否治療徹底有非常重要。

本研究我們通過對患者血清中HBV－LP、HBV DNA、HBV－M 及 Pre－S1－Ag進行了檢測，結果顯示：HBV－LP能夠反映HBV的復制情況，血清中HBVLP含量與 HBV DNA、Pre－S1－Ag和 HBeAg有著很好的相關性；且比 HBV DNA、Pre－S1－Ag和 HBeAg能更好的反映HBV復制水平；HBV－LP在 HBV感染的不同模式中：HBsAg、HBeAg、HBcAb；HB－sAg、HBeAb、HBcAb；HBsAg、HBeAg；三種模式，HBV DNA與HBV－LP的陽性率基本一致；HBsAg、HBcAb 模式HBV DNA與HBV－LP檢測陽性率差異非常大。說明HBV－LP在HBV感染血清中比HBV DNA、Pre－S1－Ag和 HBeAg更敏感，分析其原因：①血清HBeAg陰性結果不能說明不存在HBV病毒復制時［11，12］，可能與長期抗病毒治療導致基因變異造成抗原合成障礙有關；②血清HBV DNA陰性同樣不是一定表明患者體內的HBV病毒完全清除可能是因為HBV DNA檢測的靈敏度有限或水平較低，有研究表明血清HBV DNA水平較低時，肝臟內仍可存在一定量的HBV DNA；③以往檢測血清HBV－LP是通過檢測其獨有片段Pre－S1－Ag來實現(xiàn)，但是編碼Pre－S蛋白的 HBV－LP Pre－S區(qū)具有較復雜的拓撲結構［3］導致Pre－S1－Ag檢出率較低；④HBV－LP（即 HBsAg、Pre－S1蛋白和 Pre－S2蛋白）［1］，涵蓋范圍廣檢測陽性率高。HBV患者血清中 HBV－LP的檢測，可彌補HBV DNA檢測在HBV患者抗病毒治療終點判斷及療效評估中的不足，當HBV患者血清中HBeAg、HBV DNA、Pre－S1－Ag陰性時，通過檢測 HBV－LP可了解體內HBV病毒復制、疾病進展情況及抗病毒療效與預后，有效阻止病情進一步惡化。在HBV感染者HBV DNA陰性患者的血清中檢測HBV－LP陽性，對停藥反彈具有很好的臨床指導意義。

綜上所述，HBV－LP、HBV DNA、HBeAg及Pre－S1－Ag四種標志物，從靈敏度來說，HBV－LP（83.1%）＞Pre－S1－Ag（77.3%）＞ HBV DNA（73.1%）＞HBeAg（54.1%）。筆者認為對 HBV患者，特別是HBeAg和HBV DNA陰性患者，檢測血清中HBVLP含量對患者疾病進展情況及抗病毒療效與預后，阻止病情進一步惡化及對停藥反彈評估尤為重要；HBV－LP陰轉是否能作為預示抗病毒治療較為徹底有待于進一步觀察。HBV－LP檢測操作簡單、快速、無需特殊儀器設備，適合各級醫(yī)院推廣應用，尤其對那些無條件開展HBV DNA檢測單位，檢測HBV－LP就更有意義，如果條件允許同時檢測血清中HBV－M、HBV－LP、HBV－DNA 及 Pre－S1－Ag標志物能有效降低單項檢測的漏檢風險。HBV－LP可作為病毒復制指標同時也是常規(guī)檢測的一個補充指標。

［1］ Bruss V，Gerhardt E，Vieluf K，et al.Functions of the large hepations B virus surface protein in viral particle morphogenesis［J］.Interoirlogy，1996，9：23－31

［2］ Chua PK，Wang RY，Lin MH，et al.Reduced secretion of virions and Hepatitis B virus（HBV）surface antigen of a naturally occurring HBV variant correlates with the accumulation of the small S envelope protein in the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus［J］.J Virol，2005，79（21）：13483－13496.

［3］ Lambert C，Mann S，Prange R.Assessment of determinants affecting the dual topology of hepadnavirl large envelope proteins［J］.J Gen Virl，2004，85：1221－1225

［4］ 盛惠萍，楊 巖，賴雅芳，等.慢性乙型肝炎患者肝組織中HBV cccDNA定量與病情的相關性分析［J］.山東醫(yī)藥，2010，50（7）：12－14.

［5］ Buss V.Envelopment of the hepatitis B virus nucleocapsid［J］.Virus Res，2004，106：199－209

［6］ 閔福援，孫桂珍，王 建.前S1蛋白在乙型肝炎診斷及判斷預后中的作用［J］.中華醫(yī)學檢驗雜志，2004，27：224－226

［7］ 陳建芳，胡雅國，陸 軍.乙型肝炎患者血清HBV DNA與病毒復制標志物相關性探討［J］.浙江醫(yī)學，2005，17：20－21

［8］ 張 旭，鄒煥榮，黃衍鋒.前S1蛋白在乙型肝炎病毒檢測中的臨床意義［J］.醫(yī)學文選，2004，23：282－284.

［9］ 毛遠麗，李伯安，馬洪濱，等.乙肝患者外膜蛋白血清學檢測及對于判定HBV DNA復制的意義［J］.中華實驗和臨床病毒學雜志，2006，20（3）：276.

［10］ 陳曉明，楊美芳，薛 寒，等.乙型肝炎病毒大蛋白和DNA在病毒治療過程中的變化［J］.中華傳染病雜志，2007，25（7）：405－407.

［11］ 刁奇志，王貴學.HBV DNA與Pre－S1抗原均陽性患者HBeAg陰性的原因探討［J］.臨床檢驗雜志，2006，24（5）：346－347.

［12］ 陳應華，肖 艷，李 佳，等.HBeAg陰性模式與HBV DNA的關系及臨床意義［J］.遵義醫(yī)學院學報，2010，33（4）：344－345.