北冬蟲夏草、冬蟲夏草及食用菌中核苷類功效成分的比較研究

陸巍杰，唐永范，唐 亮，高瑞棟

（1.上海國(guó)寶生物工程研究所，上海 201203；2.上海國(guó)寶企業(yè)發(fā)展中心，上海 201203）

我國(guó)的地理位置和自然條件優(yōu)越，蘊(yùn)藏著豐富的食用菌資源。到目前為止，我國(guó)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)720多種食用菌，分別歸屬于144個(gè)屬，46個(gè)科。其中多數(shù)屬于擔(dān)子菌亞門，如香菇、草菇、蘑菇、木耳等；少數(shù)屬于子囊菌亞門，如羊肚菌、馬鞍菌、北冬蟲夏草、冬蟲夏草等。[1,2]

隨著人們生活水平提高、保健意識(shí)增強(qiáng)，傳統(tǒng)中藥冬蟲夏草由于其功效卓越，作用溫和，受到越來越多的關(guān)注，對(duì)它的研究也成為世界科學(xué)家們關(guān)注的焦點(diǎn)。

1 冬蟲夏草的現(xiàn)狀及人工替代途徑

1.1 冬蟲夏草生存環(huán)境的現(xiàn)狀

冬蟲夏草分布區(qū)自然生態(tài)條件嚴(yán)酷，其載體高寒草地生態(tài)系統(tǒng)極其脆弱。它對(duì)全球變化和人類活動(dòng)的擾動(dòng)極其敏感。如果對(duì)冬蟲夏草資源過度采挖。不僅會(huì)對(duì)冬蟲夏草賴以生存的高寒草地生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，而且最終導(dǎo)致冬蟲夏草因生態(tài)環(huán)境惡化而其分布區(qū)變小，資源逐漸枯竭[3]。

1.2 冬蟲夏草的人工替代途徑

1.2.1 有性型冬蟲夏草人工培養(yǎng)現(xiàn)狀

目前，有性型全人工培植冬蟲夏草沒有解決蟲與菌接種和批量、重復(fù)長(zhǎng)出子座體的難關(guān)，離小面積、小批量、多次重復(fù)在低海拔人工培育出有性型冬蟲夏草的目標(biāo)都還十分遙遠(yuǎn)。由于野生冬蟲夏草的宿主蝙蝠蛾幼蟲對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求很苛刻，人工模擬的野生環(huán)境極難控制，野生冬蟲夏草在人工環(huán)境下難以工廠化批量生長(zhǎng)。[4,5]

1.2.2 無性型冬蟲夏草人工培養(yǎng)現(xiàn)狀

蟲草菌無性型培養(yǎng)技術(shù)容易掌握，從自然界采集冬蟲夏草分離出來的真菌，絕大部分理化性質(zhì)和藥理功能與冬蟲夏草的有性成分相似，全世界不少機(jī)構(gòu)都把自我分離出的真菌確定為冬蟲夏草菌的無性階段，并紛紛建廠生產(chǎn)菌粉和開發(fā)應(yīng)用。[6]目前已從自然界的冬蟲夏草體中分離出中華蟲草菌無性型若干種，進(jìn)行深層大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)和固體培養(yǎng)菌絲體和分生孢子體作為有性型冬蟲夏草的代用品，部分廠家已進(jìn)入大的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

2 北冬蟲夏草與冬蟲夏草的區(qū)別和比較

全世界目前已發(fā)現(xiàn)大約350種蟲草，它們形態(tài)各異，寄主也各不相同。唯有主產(chǎn)于我國(guó)的冬蟲夏草和北冬蟲夏草最具藥用和食用價(jià)值。

北冬蟲夏草與冬蟲夏草比較有以下幾個(gè)特點(diǎn)：①北冬蟲夏草為蟲草屬的模式種，分布廣泛，為世界各國(guó)學(xué)者所認(rèn)識(shí)和接受。②北冬蟲夏草已經(jīng)形成了在人工條件下育成完整子座的成熟工藝。③北冬蟲夏草具有高含量的蟲草素和蟲草多糖，其獨(dú)特藥理作用已日益引起藥學(xué)界的高度重視。北冬蟲夏草中有效成分種類與冬蟲夏草相近，前者中有些成分含量甚至遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于后者。[7]-[13]

3 各種食用菌功效成分含量的測(cè)定與比較

食用菌中的功效成分包括多糖類、核苷類、多肽氨基酸類、三萜類和脂肪類等。其中多糖和腺苷類物質(zhì)是大多數(shù)食用菌都具有的重要成分，蟲草屬的真菌還含有一種獨(dú)特的核苷類功效成分——蟲草素。為了確定具體12種常見食用菌的主要功效成分，將不同來源的12種常見食用菌進(jìn)行功效成分含量的測(cè)定與比較。

3.1 實(shí)驗(yàn)原料：

3.2 液質(zhì)聯(lián)用法鑒定蟲草屬真菌核苷類主要功效成分種類

3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

a. API400型質(zhì)譜儀；b. 安捷倫1100型液相色譜儀；c. 2487UV雙波長(zhǎng)檢測(cè)器；d. 離心機(jī)。

3.2.2 實(shí)驗(yàn)條件

色譜條件:色譜柱XB-C18，5μm，4.6*250mm；檢 測(cè) 波 長(zhǎng)258nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20μL；

流動(dòng)相:含0.5%乙酸的水-甲醇（95/5，V/V）體系。

質(zhì)譜條件:MS：200～400（aum），cur：12，GS1：30 psi，GS2：30 psi，2s，500V，TEM：300℃，DP：40V，EP：8V，進(jìn)樣量5μL。

3.3 各菌菇中多糖、腺苷和蟲草素的含量測(cè)定與分析

經(jīng)比較選取了合適的方法對(duì)樣品進(jìn)行多糖、腺苷和蟲草素含量的測(cè)定。[9]-[13]

3.3.1 多糖含量的測(cè)定

按照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1676-2008，對(duì)樣品中的總多糖進(jìn)行測(cè)定。

表3-1 實(shí)驗(yàn)用食用菌菇產(chǎn)地來源

名 稱 產(chǎn) 地福建古田 福建寧德 黑龍江長(zhǎng)白山 西藏 青海 上海姬松茸 野生 人工平 菇 野生 人工雞腿菇 野生 人工牛肝菌 野生 人工灰樹花 野生 人工香 菇 野生 人工 野生猴頭菇 野生 人工 野生小青蘑 野生小黃蘑 野生白 蘑 野生花臉蘑 野生金針菇人工冬蟲夏草 野生 野生北冬蟲夏草 野生國(guó)寶北冬蟲夏草人工

3.3.2 腺苷含量的測(cè)定

按照高效液相色譜法（藥典2000版 附錄VI D）[14]

色譜條件：色譜柱XB-C18，5μm，4.6*250mm； 檢 測(cè) 波 長(zhǎng)260nm；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量20μL；

流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液(pH6.5):甲醇(17:3，V/V)體系。

腺苷平均加樣回收率為100.23%，RSD=1.35%。

3.3.3 蟲草素的測(cè)定方法

依照高效液相色譜法（藥典2000版 附錄VI D）[14]

色譜條件：色譜柱XB-C18，5μm，4.6*250mm； 檢 測(cè) 波 長(zhǎng)258nm；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量20μL；

流動(dòng)相：含0.5%乙酸的水-甲醇（95/5，V/V）體系。

蟲草素平均加樣回收率為99.72%，RSD=1.43%。

3.4 結(jié)果分析及討論

3.4.1 組分定性、MS驗(yàn)證西藏野生蟲草和國(guó)寶北冬蟲夏草

經(jīng)LC-MS組分定性、質(zhì)譜圖比對(duì)，在268.0和251.9都出現(xiàn)了質(zhì)譜峰，說明國(guó)寶北冬蟲夏草中的兩個(gè)主要功效成分與野生冬蟲夏草中的特有活性成分蟲草素和腺苷的核質(zhì)比一致。經(jīng)過與文獻(xiàn)中野生冬蟲夏草的質(zhì)譜峰對(duì)比一致，表明國(guó)寶北冬蟲夏草中也含有冬蟲夏草中的特有活性成分蟲草素和腺苷。[8]

3.4.2 各菌菇中多糖、腺苷和蟲草素的含量測(cè)定結(jié)果與分析

由表3-2可以看出：①腺苷普遍存在于常見食用菌中，并且根據(jù)食用菌種類的不同腺苷含量各有高低。②本實(shí)驗(yàn)收集了我國(guó)南方、北方、野生、人工培育的各種食用菌分部位進(jìn)行腺苷含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)傘菌的食用菌其菌傘部位的腺苷含量高于菌柄部位的腺苷含量，一般菌傘腺苷含量為菌柄腺苷含量的1-4倍。③蟲草屬真菌的分部位含量測(cè)定比較則是按草和蟲兩個(gè)部位來劃分的，其中野生冬蟲夏草中的腺苷主要存在于草的部分，蟲的部分腺苷含量較低，前者約為后者的3-4倍。國(guó)寶北冬蟲夏草子實(shí)體中的腺苷為0.070%，與西藏蟲草（草部位）的0.069%和青海蟲草（草部位）的0.071%相近。

表3-2 各種食用菌菇有效成分含量測(cè)定

另外，表3-2結(jié)果表明：蟲草素作為蟲草屬真菌的特有功效成分，僅存在于冬蟲夏草和北冬蟲夏草這兩個(gè)蟲草屬中，在其他食用菌中均未檢出。野生冬蟲夏草的蟲草素含量較低，約為0.10%左右，但從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到草部位比蟲部位的蟲草素含量高。野生北冬蟲夏草中的蟲草素含量是冬蟲夏草的10倍左右，而國(guó)寶北冬蟲夏草子實(shí)體中的蟲草素含量為1.92%，是野生北冬蟲夏草的15倍，超過冬蟲夏草150倍。

各地各屬種食用菌中的多糖含量都比較高，基本都在10%以上，有的食用菌，如小青蘑、雞腿蘑甚至超過20%接近30%。通過對(duì)傘菌（擔(dān)子菌亞門）的菌傘和菌柄多糖含量測(cè)定比較發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)菌柄中的多糖含量近似等于或略高于菌傘中的多糖含量，前者約為后者的1-1.5倍。而對(duì)蟲草屬的真菌進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，野生北冬蟲夏草、國(guó)寶北冬蟲夏草的多糖含量與野生冬蟲夏草多糖含量相當(dāng)，都在10%-13%之間。

4 討論

由于野生冬蟲夏草對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻，并且用人工替代培育野生冬蟲夏草效果不佳，通過對(duì)野生冬蟲夏草和北冬蟲夏草的LC-MS組分定性、質(zhì)譜圖比對(duì)，證實(shí)國(guó)寶北冬蟲夏草中的兩個(gè)主要功效成分與野生冬蟲夏草中的特有活性成分蟲草素和腺苷的核質(zhì)比一致。通過對(duì)各菌菇中多糖、腺苷和蟲草素的含量測(cè)定，表明，腺苷普遍存在于常見食用菌中，許多真菌和植物都含有活性多糖，蟲草酸又稱為D-甘露醇，僅是普通生化物質(zhì)。只有蟲草素，作為蟲草屬真菌的特有功效成分，僅存在于冬蟲夏草和北冬蟲夏草中，是其它食用真菌所不含有的。蟲草素作為一種重要的生物活性物質(zhì)，一直缺乏有利開發(fā)。究其原因，一方面是由于生產(chǎn)者對(duì)蟲草素這一重要活性成分重視程度不夠，另一方面也是因?yàn)槟壳吧袩o相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)冬蟲夏草及北冬蟲夏草中蟲草素的含量。國(guó)寶北冬蟲夏草與野生冬蟲夏草中的真菌多糖含量相當(dāng)，腺苷含量國(guó)寶北冬蟲夏草高于野生蟲草，特有功效成分蟲草素含量國(guó)寶北冬蟲夏草遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生蟲草，而且國(guó)寶北冬蟲夏草培育周期短，人工培育技術(shù)成熟，可以大規(guī)模生產(chǎn)，是實(shí)現(xiàn)野生冬蟲夏草工廠化培育的最佳替代品。

研究表明，蟲草素具有抗腫瘤、抗白血病、免疫調(diào)節(jié)、抗纖維化、抗疲勞等多種功效。[15]-[18]以前由于原料稀少、價(jià)格昂貴（近期，Sigma蟲草素標(biāo)價(jià)為70000元/克），對(duì)蟲草素的研究還不夠深入、系統(tǒng)?，F(xiàn)在以蟲草素為主要質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行的北冬蟲夏草工廠化大規(guī)模生產(chǎn)為蟲草素的提取提供了充足的原料，如果能夠以成熟的工藝、低成本、大批量提取制備蟲草素，將蟲草素研發(fā)成為新一代藥物的前景廣闊。

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