米爾頓姬小蜂線粒體16S rRNA與COⅠ基因片段序列測定及分析

黃蓬英，林玲玲，洪欽陽，廖富榮廈門出入境檢驗檢疫局，福建廈門3606;福建農(nóng)林大學植物保護學院，福建福州35000

米爾頓姬小蜂 Anselmella miltoni Girault，屬膜翅目Hymenoptera小蜂總科Chalcidoidea姬小蜂科Eulophidae Anselmella屬，最早僅分布于澳大利亞，現(xiàn)已擴散至我國臺灣地區(qū)。其幼蟲以取食蒲桃屬Syzygium的種子為生，嚴重影響水果的產(chǎn)量和食用價值(黃蓬英等，2008)。2007、2009年廈門檢驗檢疫局對來自臺灣的蓮霧Eugenia javanica Lam實施檢疫時發(fā)現(xiàn)該蟲。目前，有關米爾頓姬小蜂的研究較少，尤對其生物學、種群遺傳等特性缺乏深入的研究。

昆蟲的線粒體基因(mtDNA)大小一般為15.4～16.3 kb。16S rRNA是mtDNA上進化速率中等的基因，其序列高度保守，常被用于高級分類階元的系統(tǒng)進化和分類鑒定(黃華平等，2006;龍健和龐虹，2003;蘇成勇等，2007)。線粒體細胞色素氧化酶第Ⅰ亞基(cytochrome oxidase subunitⅠ，COⅠ)是保守性中等的基因區(qū)段，目前已被廣泛用于昆蟲種間、尤其是種內的遺傳變異研究(竇向梅等，2005)。以上述2個基因片段序列作為DNA條形碼，已成為生物分類領域的研究熱點。迄今為止，有關米爾頓姬小蜂線粒體16S rRNA和COⅠ基因序列尚未見報道。本研究通過PCR擴增，測定16S rRNA和COⅠ部分序列，并對其進行分析，以期為米爾頓姬小蜂的分子鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用蟲樣為廈門檢驗檢疫局從臺灣蓮霧上截獲的米爾頓姬小蜂成蟲。標本浸泡在無水乙醇中，－70℃保存。取米爾頓姬小蜂成蟲5頭于雙蒸水中漂洗，用吸水紙吸干備用。

1.2 主要生化試劑和儀器

基因組DNA提取試劑盒Universal Genomic DNA Extraction Kit、dNTP Mixture(2.5 mmol·L－1)購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司;Dream TaqTMDNA Polymerase(5 U·μL－1)、10 × Dream TaqTMBuffer(含 20 mmol·L－1MgCl2)購自 Fermentas公司;100 bp DNA Ladder購自天根生化科技(北京)有限公司;PCR引物合成、克隆及測序委托上海生工生物工程公司完成;PCR儀為ABI公司的Applied Biosystems Thermal Cycler Veriti 96 Well。

1.3 總DNA的提取

基因組DNA提取參照試劑盒說明書(TaKaRa，Kit Ver.3.0)的方法。

1.4 PCR擴增及電泳

16S rRNA基因序列的PCR擴增引物參考Szalanski et al.(2008)，上 游 引 物 為 LR-J-13007(5'-TTACGCTGTTATCCCTAA-3')，下游引物為LR-N-13398(5'-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3');COⅠ基因序列的擴增引物參考Kolesik et al.(2009)，上游引物為COⅠs(5'-GGATCACCTGATATAGCATTCCC-3')，下游引物為COⅠa(5'-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3')。

PCR反應的總體積為50 μL，其中包括10×Dream TaqTMBuffer(含20 mmol·L－1MgCl2)5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L－1)4 μL，上、下游引物(10 μmol·L－1)各 2 μL，Dream TaqTMDNA Polymerase(5 U·μL－1)0.25 μL，模板 DNA 4 μL，加滅菌雙蒸水至終體積。

PCR反應程序:95℃預變性3 min;94℃變性45 s，53℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán);最后72℃延伸7 min。

1.5 克隆測序與序列分析

將PCR產(chǎn)物回收純化后進行克隆及測序。將獲得的DNA序列通過NCBI進行BLAST相似性檢索，經(jīng)人工核對后確認所得的序列片段，然后用DNAMAN和DNACLUB軟件對序列進行剪裁與分析。

從GenBank上下載姬小蜂科的Chrysocharis nautilus(Walker)(GenBank登錄號:HM573784)、C.eurynota Graham(GenBank登錄號:HM573749)，蚜小蜂科的Encarsia berlesei(Howard)(GenBank登錄號:GQ922199)，赤眼蜂科的Trichogramma nmwanzai Schulten(GenBank 登錄號:DQ177920)、T.brasiliensis Ashmead(GenBank登錄號:DQ177919)，金小蜂科的 Pteromalus sp.(GenBank登錄號:HM574095)、NasonialongicornisDarling(GenBank登錄號:GQ336371)的序列進行比較，并采用DNAMAN上的Maximum Likelihood方法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 米爾頓姬小蜂16S rRNA和COⅠ PCR擴增

利用2對通用引物對米爾頓姬小蜂進行PCR擴增。引物LR-J-13007/LR-N-13398擴增到16S rRNA約420 bp的條帶;引物COⅠs/COⅠa擴增到COⅠ基因約490 bp的條帶(圖1)。

2.2 序列分析

2.2.1 米爾頓姬小蜂16S rRNA序列分析 克隆測序結果表明，米爾頓姬小蜂16S rRNA基因序列為426 bp(圖2)。同源性比較發(fā)現(xiàn)，該序列與數(shù)據(jù)庫中部分物種的序列有很高的同源性，因而確定克隆片段為16S rRNA基因部分序列。A、T、C、G平均含量分別為 175 bp(41.10%)、182 bp(42.70%)、39 bp(9.20%)、30 bp(7.00%)，且 A+T 含量(83.80%)大于 G+C 含量(16.20%)。

圖1 米爾頓姬小蜂16S rRNA和COⅠ基因的PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification products of 16S rRNA and COⅠgenes in A.miltoni

2.2.2 米爾頓姬小蜂COⅠ序列分析 克隆測序結果表明，米爾頓姬小蜂 COⅠ基因序列為488 bp(圖3)。同源性比較發(fā)現(xiàn)，該序列與數(shù)據(jù)庫中部分物種的序列有很高的同源性，因而確定克隆片段為COⅠ基因部分序列。A、T、C、G平均含量分別為144 bp(29.51%)、211 bp(43.24%)、70 bp(14.34%)、63 bp(12.91%)，且 A+T 含量(72.75%)大于 G+C 含量(27.25%)。

2.2.3 基于COⅠ部分序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹 根據(jù)COⅠ部分序列，利用DNAMAN的Maximum Likelihood方法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4。米爾頓姬小蜂與蚜小蜂科的E.berlesei親緣關系最近，與姬小蜂科的C.nautius、C.eurynota親緣關系較遠。而按照形態(tài)學分類，米爾頓姬小蜂應與后者親緣關系較近。這可能與米爾頓姬小蜂是植食性小蜂，而其他種類是寄生蜂有關。

圖2 米爾頓姬小蜂16S rRNA基因部分序列Fig.2 16S rRNA partial sequences in A.miltoni

圖3 米爾頓姬小蜂COⅠ基因部分序列Fig.3 COⅠ partial sequences in A.miltoni

3 結論與討論

本研究測定了米爾頓姬小蜂線粒體16S rRNA和COⅠ基因的部分序列，并分析了相應序列的堿基組成特征。結果表明，其16S rRNA和COⅠ基因的A+T含量分別為83.80%和72.75%，均明顯高于C+G含量。該結果與其他昆蟲的16S rRNA和COⅠ基因研究結果(譚宏偉等，2009;趙惠玲等，2010;鄭福山等，2007)相符，即存在較強的A+T偏好性，這與昆蟲線粒體基因的堿基組成特征基本一致。

根據(jù)COⅠ部分序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，米爾頓姬小蜂與蚜小蜂科的E.berlesei親緣關系最近，與姬小蜂科的 C.nautius、C.eurynota 親緣關系較遠。

本研究獲得了米爾頓姬小蜂線粒體16S rDNA和COⅠ基因的部分序列，為今后米爾頓姬小蜂的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育研究等奠定了基礎?；贑OⅠ基因的條碼技術已廣泛應用于昆蟲的分子鑒定，因此，設計米爾頓姬小蜂特異引物進行分子鑒定是下一步的工作重點。此外，米爾頓姬小蜂已入侵我國臺灣地區(qū)，隨著臺灣水果進口量的不斷增多，我國大陸也存在米爾頓姬小蜂大量入侵的風險，因此應引起有關部門的高度重視。

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