山梨酸鉀的毒理學(xué)評(píng)價(jià)

曾 婷，謝逸欣，馬 麗

（廣州軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 510507）

山梨酸鹽是一種抗菌防腐劑，具有抗細(xì)菌和抗真菌的性質(zhì)，通常用于口服和局部用制劑中，特別是含有非表面活性劑的制劑中，常用濃度是0.1%～0.2%。一般認(rèn)為它是相對(duì)無毒的食品添加劑，但是，也有一些關(guān)于山梨酸鹽不良反應(yīng)的報(bào)道，包括皮膚刺激性、過敏性或超敏性反應(yīng)，然而口服山梨酸鹽未見系統(tǒng)不良發(fā)應(yīng)的報(bào)道[1]。為了探明其食用的安全性，現(xiàn)對(duì)其常用品種山梨酸鉀進(jìn)行安全毒理學(xué)評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 樣品 山梨酸鉀(河南浩鑫生物科技有限公司，純度>98%)，白色結(jié)晶性粉末，無異味，易吸濕。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～22 g；于2008年購入即用于本實(shí)驗(yàn)，由四川省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(川動(dòng)管字第2008 09號(hào))。實(shí)驗(yàn)環(huán)境：溫度23℃～25℃，相對(duì)濕度65%～70%。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 根據(jù)衛(wèi)生部2003年發(fā)布的《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序》(GB15193)中要求的方法進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)[2]。實(shí)驗(yàn)中以實(shí)際給藥量為依據(jù)，配制相應(yīng)濃度的山梨酸鉀水溶液，即配即用。

1.3.1 急性毒性實(shí)驗(yàn) 將昆明小鼠40只隨機(jī)分為對(duì)照組及受試組各20只，雌雄各半，分養(yǎng)在4個(gè)籠里。采用寇氏法測定LD50。實(shí)驗(yàn)過程：實(shí)驗(yàn)小鼠隔夜空腹，24 h內(nèi)口服給藥(灌胃)，給藥量為0.4 ml/20 g。三周內(nèi)連續(xù)觀察，記錄動(dòng)物進(jìn)食、一般活動(dòng)(中毒表現(xiàn))、大小二便以及死亡情況[3]，并計(jì)算LD50。

1.3.2 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 小鼠50只，隨機(jī)分為5組，雌雄各半。根據(jù)本品LD50=1 300 mg/kg設(shè)3個(gè)劑量組，分別為高劑量組(1/2 LD50=650 mg/kg)、中劑量組(1/4 LD50=325 mg/kg)、低劑量組(1/8 LD50=162.5 mg/kg)；并且設(shè)立溶劑對(duì)照組和陽性對(duì)照組共五個(gè)組別。陽性對(duì)照組在間隔24 h內(nèi)，用環(huán)磷酰胺40 mg/kg連續(xù)灌胃兩次，在最后一次給藥后的6 h，勁椎脫位處死小鼠，將股骨骨髓腔制成的細(xì)胞懸液涂片置于Giemsa應(yīng)用液中染色，在油鏡下觀察。用雙盲法閱片，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，觀察含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，微核率以千分率表示[4]。

1.3.3 小鼠精子畸形試驗(yàn) 將雄性小鼠50只隨機(jī)分為五組，根據(jù)本品LD50=1 300 mg/kg設(shè)3個(gè)劑量組：高劑量組(1/2 LD50=650 mg/kg)、中劑量組(1/4 LD50=325 mg/kg)、低劑量組(1/8 LD50=162.5 mg/kg)；另設(shè)溶劑對(duì)照組和陽性對(duì)照組。陽性對(duì)照組以甲基磺酸甲酯(MMS)50 mg/kg體重灌胃。各組小鼠連續(xù)給藥5 d，于第一次給藥后的第35天處死，取出兩側(cè)附睪，常規(guī)制片，用伊紅染色1 h，在高倍鏡下檢查精子形態(tài)，計(jì)數(shù)結(jié)構(gòu)完整精子。每只動(dòng)物觀察1 000個(gè)精子形態(tài)(無鉤、香蕉形、胖頭、無定性、尾折疊、雙頭、雙尾等)并計(jì)數(shù)[5]。

1.3.4 致畸試驗(yàn) 選用健康、性成熟且未交配的雌性小鼠40只以及雄性小鼠20只，隨機(jī)分為四組，雌雄各半，根據(jù)本品LD50=1 300 mg/kg設(shè)3個(gè)劑量組，分別為高劑量組(1/2 LD50=650 mg/kg)、中劑量組(1/4 LD50=325 mg/kg)、低劑量組(1/8 LD50=162.5 mg/kg)和溶劑對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)小鼠按照雌雄動(dòng)物1:1比例同籠后，每日早晨檢查陰栓(或陰道涂片)，查出陰栓(或精子)則認(rèn)為該鼠已經(jīng)交配，當(dāng)日作為受孕0 d。如果5 d內(nèi)未交配，則更換雄鼠。檢出的妊鼠隨機(jī)分組，并稱重和編號(hào)，在受孕的第7～16天，每天給予本品。分別于受孕的0 d、7 d、12 d、16 d、10 d稱重。每組實(shí)驗(yàn)孕鼠于妊娠第20天勁椎脫位處死5只，剖腹取出子宮稱重，記錄并檢查吸收胎、早死胎、晚死胎及活胎數(shù)?；钐ナ蟪錾?4 h內(nèi)逐一記錄性別、體重、體長，對(duì)胎鼠進(jìn)行體表檢查(頭部、軀干部、四肢)，觀察是否有異常。定時(shí)稱量體重，斷乳時(shí)處死解剖，檢查骨骼以及內(nèi)臟(頭部、胸部、腹部)有無畸形[6]。

1.3.5 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn) 小鼠80只隨機(jī)分成四組，每組20只，雌雄各半，根據(jù)本品LD50=1 300 mg/kg設(shè)3個(gè)劑量組，分別為高劑量組(1/4 LD50=325 mg/kg)、中劑量組(1/8 LD50=162.5 mg/kg)、低劑量組(1/12 LD50=108.3 mg/kg)和溶劑對(duì)照組。連續(xù)30 d，各劑量組按照相應(yīng)劑量口服給藥(灌胃)，溶劑對(duì)照組給予蒸餾水。每周觀察并記錄小鼠的一般表現(xiàn)、行為、中毒表現(xiàn)和死亡情況。每周稱1次體重和食物攝入量。實(shí)驗(yàn)至30 d時(shí)，眼眶取血后頸椎脫位處死。測定紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)等血液學(xué)指標(biāo)以及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、尿素氮(BUN)、血糖(GLU)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)等血液生化學(xué)指標(biāo)；對(duì)肝、腎、脾、胃腸等重要臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布的比較采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的比較采用卡方檢驗(yàn)。計(jì)量資料采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 急性毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)期間，中、高劑量組部分小鼠出現(xiàn)了中毒癥狀，主要表現(xiàn)：反應(yīng)遲鈍，行為呆滯，缺乏知覺，呼吸減弱，流涎流淚等，同時(shí)有2只小鼠死亡。經(jīng)查表得LD50=1 300 mg/kg，因此，本品屬于低毒級(jí)。

2.2 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，各實(shí)驗(yàn)組微核率均為1.8‰，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；和陽性對(duì)照組22.0‰比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果見表1。

表1 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn) 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，各劑量組小鼠精子畸形率分別為2.84%、2.88%、2.94%，與溶劑對(duì)照組2.58%比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；和陽性對(duì)照組98.36%比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果見表2。

表2 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果(只)

2.4 傳統(tǒng)致畸試驗(yàn) 小鼠妊娠前后的一般情況良好，且藥物對(duì)其生殖能力并無明顯影響。孕鼠妊娠14 d處死后，各劑量組與溶劑對(duì)照組比較，在吸收胎、早死胎、晚死胎及活胎數(shù)方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。各劑量組胎鼠體重、體長增長速度均無異常，各劑量組與溶劑對(duì)照組比較差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。肉眼檢查胎鼠體表、頭部、軀干部及四肢未見明顯異常和畸形。處死后，檢查枕骨、脊椎骨、骨盆等骨骼，未見明顯異常和畸形。檢查頭部、胸部、腹部的內(nèi)臟，在大小、形態(tài)等方面未見明顯異常和畸形。

表3 山梨酸鉀對(duì)胎仔影響試驗(yàn)結(jié)果比較(只)

表4 山梨酸鉀對(duì)胎鼠出生后體重增長情況比較(±s)

表4 山梨酸鉀對(duì)胎鼠出生后體重增長情況比較(±s)

組別 動(dòng)物數(shù)(只)出生時(shí)間(d)07低劑量組中劑量組高劑量組溶劑對(duì)照組劑量(mg/kg)162.5 325 650 0 5555 1.70±0.20 1.69±0.21 1.65±0.19 1.71±0.22 3.56±0.35 3.51±0.41 3.49±0.32 3.61±0.40 14 5.59±0.40 5.52±0.44 5.33±0.47 5.66±0.42 21 12.01±0.61 11.95±0.57 11.92±0.60 12.02±0.53

2.5 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

2.5.1 動(dòng)物一般情況 實(shí)驗(yàn)過程中無動(dòng)物死亡，各組動(dòng)物毛發(fā)正常，無異常行為表現(xiàn)。在體重和食物攝入量方面，各劑量組動(dòng)物與溶劑對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5.2 血液常規(guī)檢查 本實(shí)驗(yàn)中，各劑量組與溶劑對(duì)照組動(dòng)物的RBC、WBC等血液學(xué)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5.3 各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物血清生化指標(biāo) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，高劑量組與溶劑對(duì)照組動(dòng)物的指標(biāo)TC、TG比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表5。

表5 血液生化指標(biāo)結(jié)果(±s)

表5 血液生化指標(biāo)結(jié)果(±s)

注：實(shí)驗(yàn)組與溶劑對(duì)照組比較，*P<0.01。

組別低劑量組中劑量組高劑量組溶劑對(duì)照組劑量(mg/kg)108.3 162.5 325 0動(dòng)物數(shù)(只)20 20 20 20 ALT(U/L)48.6±4.1 49.2±4.1 51.5±4.3 45.8±3.6 BUN(mmol/L)8.37±0.86 8.37±0.79 10.68±1.01 7.56±0.81 GLU(mmol/L)5.26±0.43 5.37±0.45 5.89±0.59 4.98±0.39 TC(mmol/L)1.25±0.30 1.27±0.33 1.75±0.42*1.18±0.08血液生化指標(biāo)TG(mmol/L)0.73±0.06 0.77±0.07 1.02±0.15*0.51±0.05

2.5.4 病理學(xué)檢查 在組織病理學(xué)檢查中，觀察各劑量組相對(duì)于溶劑對(duì)照組的動(dòng)物臟器是否具有明顯改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在外觀、大小等各方面，心、肝、脾、肺、腎、胃腸等重要臟器均正常，未見明顯的毒性病理改變。

3 討論

根據(jù)以上毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)了山梨酸鉀對(duì)動(dòng)物機(jī)體無毒害，加上其具有較廣的抗菌譜，對(duì)霉菌、酵母菌等均有抗菌性，是一種典型的酸性防腐劑，在人體正常的代謝下，大部分會(huì)代謝生成二氧化碳和水從人體排出。本實(shí)驗(yàn)中通過對(duì)小鼠進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，得到其LD50=1 300 mg/kg，表示山梨酸鉀為低毒級(jí)物質(zhì)；通過骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)，證實(shí)山梨酸鉀無致突變的作用；在小鼠精子畸形試驗(yàn)中也證實(shí)了本品無遺傳毒性及潛在的致癌作用；通過傳統(tǒng)致畸試驗(yàn)顯示本品無致畸作用；在急性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)，對(duì)動(dòng)物體重和食物攝取量的觀察，RBC、WBC等血液學(xué)指標(biāo)以及ALT、BUN、GLU、TC、TG等血液生化學(xué)指標(biāo)的分析，對(duì)肝、腎、脾、胃腸等重要臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，進(jìn)一步證明山梨酸鉀對(duì)動(dòng)物機(jī)體無毒害。

本實(shí)驗(yàn)中，血清生化指標(biāo)中膽固醇有隨試驗(yàn)劑量增高而增高的趨勢，但無劑量反應(yīng)關(guān)系，而且山梨酸鉀濃度過大，實(shí)際用量將稀釋許多倍，但為安全起見，建議進(jìn)一步做大鼠90 d喂養(yǎng)等試驗(yàn)，以長期對(duì)山梨酸鹽進(jìn)行更深入細(xì)致的研究。

毒理學(xué)安全評(píng)價(jià)是衡量食品添加劑毒性大小的重要依據(jù)，各種添加劑能否使用以及使用范圍和最大使用量應(yīng)嚴(yán)格按照《食品添加劑管理辦法》的規(guī)定操作，以保證其在安全范圍內(nèi)使用。中國衛(wèi)生部發(fā)布的《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中有規(guī)定，山梨酸鉀在不同食物中的使用量是在0.075～2.01 g/kg的范圍內(nèi)，這個(gè)限量相對(duì)于日本的《食品衛(wèi)生法》和世界衛(wèi)生組織聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織制定的《國際食品法典委員會(huì)(CAC)標(biāo)準(zhǔn)》中的規(guī)定限量遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏低。當(dāng)然，各國制定的標(biāo)準(zhǔn)可能與每個(gè)國家的飲食、環(huán)境、生活方式等的不同有很大的關(guān)系。

綜上所述，可以斷定山梨酸鉀是安全的，可作為食品、藥品、飼料等領(lǐng)域的防腐劑，商業(yè)前景十分廣泛。

[1] 鄭俊民.藥用輔料手冊(cè)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:581-583.

[2] 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全性毒性學(xué)評(píng)價(jià)-食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn),GB15193.1-2003.

[3] 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全性毒性學(xué)評(píng)價(jià)-急性毒性實(shí)驗(yàn).中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn),GB15193.3-2003.

[4] 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全性毒性學(xué)評(píng)價(jià)-骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn).中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn),GB15193.5-2003.

[5] 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全性毒性學(xué)評(píng)價(jià)-小鼠精子畸形試驗(yàn).中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn),GB15193.7-2003.

[6] 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全性毒性學(xué)評(píng)價(jià)-致畸試驗(yàn).中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn),GB15193.14-2003.

[7] 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全性毒性學(xué)評(píng)價(jià)-90天和30天喂養(yǎng)試驗(yàn).中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn),GB15193.13-2003.