難治性顳葉癲癇海馬星形膠質細胞中P-gp、p53表達與凋亡探討

段寶奇，劉 憶，胡 靜，高覺民

(江蘇省中醫(yī)院神經外科1、血液凈化中心2，江蘇 南京 210029)

難治性顳葉癲癇易引起早逝、外傷、精神病、認知障礙等嚴重后果[1]，多需要手術切除海馬，雖然諸多學者對海馬神經元改變致耐藥難治等進行廣泛研究，但關于海馬星形膠質細胞在其中的作用研究較少。本文通過免疫組化、免疫印跡法(Western blot)、原位末端標記(TUNEL)方法檢測P-gp、p53和細胞凋亡在星形膠質細胞的表達，探討其在難治性顳葉癲癇患者中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 17例難治性顳葉癲癇手術患者為2005年4月至2011年8月在我科手術的患者，其中男性7例，女性10例，年齡8～36歲，平均23.5歲，病程3～32年，平均10.5年。所有患者均正規(guī)服用抗癲癇藥物治療兩年以上，仍不能控制發(fā)作，平均每個月發(fā)作>3次。術前患者均進行了長程視頻腦電圖檢測棘波定位于顳葉；頭部MR檢查符合海馬硬化診斷標準；癲癇血藥濃度檢測在有效濃度范圍；均在皮層和深部電極監(jiān)測下行前顳葉切除術。對照組為手術內減壓治療嚴重顱腦外傷3例和半球腦梗塞2例，均無癲癇發(fā)作史。所有患者均有患者或家屬簽署手術同意書。

1.2 標本 手術切除的每例腦組織標本均留取部分放入液氮保存?zhèn)溆?，其余?%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切成6 μm厚的切片，備行免疫組化和凋亡檢測。

1.3 主要試劑 P-糖蛋白抗體購自Santa Cruz公司；p53抗體、β-action和二抗購自武漢博士德公司；原位末端標記檢測細胞凋亡(TUNEL)試劑盒由Roche公司提供；即用型快速免疫組化MaxVision試劑盒，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑等購自福州邁新生物公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 采用即用型快速免疫組化MaxVision試劑盒。分別加入P-gp、p53一抗，37℃孵育1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2 min×3次，滴加MaxVision二抗，37℃或室溫孵育10～15 min，PBS沖洗2 min×3次，DAB顯色，蘇木素復染。P-gp在胞膜和胞漿、p53在胞核染成黃色或棕色為陽性。在高倍顯微鏡下隨機選取視野，計數(shù)100個細胞中的陽性細胞個數(shù)，重復5次，取其均值。

1.2.2 凋亡細胞檢測 使用TUNEL試劑盒進行檢測，按說明書操作，以細胞核染成紫褐色為陽性。在高倍顯微鏡下隨機選取視野，計數(shù)100個細胞中的陽性細胞個數(shù)，重復5次，取其均值。

1.2.3 免疫印跡法 取出液氮保存的腦組織標本，在冰浴下用玻璃研磨器磨碎，加入細胞裂解液裂解細胞1 h；4℃下12 000 r/min離心20 min，取上清后采用Bradford比色法進行蛋白定量。取等量的蛋白樣品，經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉運于硝酸纖維素膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，洗膜后分別與一抗P-gp(1:500)、p53(1:200)及β-抗體(1:6000)孵育4℃過夜，次日TBST洗脫5 min共3次，加HRP標記的二抗(1:400)孵育2 h。加入增強化學發(fā)光劑中反應數(shù)分鐘，最后以高效顯影膠片曝光并沖洗膠片。Labworks軟件分析結果時以蛋白條帶作為內參照。計算P-gp、p53蛋白條帶及β白條帶與內參照蛋白條帶像素灰度的百分比值，作為蛋白表達的相對水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有的實驗結果以均數(shù)±標準差(±s)表示，兩組間的比較采用t檢驗，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 P-gp免疫組化 對照組P-gp只在微血管內皮細胞膜表達，而實驗組微血管內皮細胞和部分星形膠質細胞膜都有表達(圖1)。

圖1 P-gp免疫組化(×200)

2.2 p53免疫組化 對照組未見明顯p53陽性細胞，實驗組有14例可見p53陽性細胞，主要為星形膠質細胞，少部分神經元細胞(圖2)。

圖2 p53免疫組化(×200)

2.3 TUNEL 對照組未見凋亡陽性細胞，實驗組可見凋亡陽性細胞，主要為星形膠質細胞，少數(shù)神經元細胞(圖3)。

圖3 TUNEL(×200)

2.4 Western blot分析 P-gp和p53在癲癇患者中表達較對照組明顯增高(圖4、圖5)。

圖4 Western blot分析

圖5 Western blot分析

2.5 統(tǒng)計學分析 顯微計數(shù)顯示實驗組P-gp、p53免疫組化和凋亡陽性細胞較對照組明顯增加；Western blot分析提示實驗組P-gp、P53較對照組表達明顯增加，結果見表1。

表1 兩組免疫組化(p53、P-gp)、TUNEL、Western blot結果(±s)

表1 兩組免疫組化(p53、P-gp)、TUNEL、Western blot結果(±s)

注：t檢驗，P<0.05。

組別對照組實驗組17例數(shù)5 P-gp 0 13.84±7.73 P53 0 10.47±7.52 TUNEL 0 5.82±3.41 P-gp 0.72±0.14 1.43±0.42 P53 0.37±0.16 1.26±0.37 Western blot

3 討論

顳葉癲癇多為難治性癲癇，即表現(xiàn)出對多種抗癲癇藥物耐藥，人們發(fā)現(xiàn)多藥轉運體與耐藥相關，其中又以P-gp的作用為著。P-gp是多耐藥基因編碼的170 kD膜蛋白，在正常腦組織中主要在微血管內皮細胞表達，可阻止內源性和外源性物質進入中樞神經系統(tǒng)，成為血腦屏障作用的一部分，許多抗癲癇藥物也是其作用底物而被排出細胞膜外。癲癇發(fā)作可以造成內皮細胞損傷，血腦屏障被破壞，進而構成第二道屏障的膠質細胞產生級聯(lián)反應，也高表達P-gp。從本組實驗我們發(fā)現(xiàn)：實驗組免疫印跡法顯示P-gp較對照組有更高的表達；而免疫組化顯示除血管內皮細胞外有部分星形膠質細胞P-gp陽性，對照組未見陽性P-gp膠質細胞。膠質細胞P-gp高表達，可進一步限制抗癲癇藥物作用于異常放電的神經元[2]，促成癲癇耐藥難治。

難治性顳葉癲癇多有海馬神經元丟失、凋亡及膠質細胞反應性增生，本組實驗我們也有相似發(fā)現(xiàn)。同時免疫組化和免疫印跡法發(fā)現(xiàn)實驗組膠質細胞較對照組有明顯的p53高表達，這與Engel等[3]、Xu等[3]報道結果一致。而TUNEL發(fā)現(xiàn)星形膠質細胞較神經元凋亡明顯，這可能是由于：(1)腦組織中膠質細胞為神經元細胞的20～50倍，而硬化海馬組織中神經元丟失較多，使神經元和膠質細胞比例進一步下降，導致實驗組可見的神經元細胞數(shù)量減少。(2)癲癇患者的硬化海馬組織中神經元細胞以壞死為主要方式，凋亡可能是次要原因[4]。(3)癲癇發(fā)作多伴有腦組織的缺氧，而在體條件下星形膠質細胞比神經元更易受損；且海馬區(qū)星形膠質細胞比神經元更易發(fā)生凋亡；同時反應性星形膠質細胞化后，星形膠質細胞更容易發(fā)生死亡[5]。結合本組實驗結果，我們認為調控細胞凋亡的p53在星形膠質細胞高表達，也支持星形膠質細胞較神經元細胞更易發(fā)生凋亡。

隨著分子生物學的研究深入，人們在癲癇研究中發(fā)現(xiàn)P-gp、p53與凋亡之間有密切關系。如Morrison等[6]發(fā)現(xiàn)敲除p53的小鼠可以減少癲癇發(fā)作導致的細胞凋亡，并認為缺少p53在癲癇發(fā)作中有減少凋亡作用，p53參與了凋亡的調控。而Engel等[3]發(fā)現(xiàn)在顳葉癲癇患者海馬組織內p53表達上升和凋亡表現(xiàn)，并認為癲癇后受損細胞可以通過p53途徑誘導凋亡。研究發(fā)現(xiàn)p53也參與了P-gp的調控[7]，如表達P-gp的MDR-1下游啟動子有p53的結合位點，從而調節(jié)P-gp表達；p53還可以與轉錄調節(jié)因子ETS-1協(xié)同作用或者通過對核因子R33等多種細胞因子做出反應而增加P-gp的表達，雖然其中可能有p53變異的結果，但野生型p53也同樣具有類似的作用。動物模型發(fā)現(xiàn)癲癇可以促使p53和P-gp的表達，同樣癲癇患者中P-gp表達明顯加強[2]。結合本組實驗結果，我們認為由于癲癇的反復發(fā)作，腦組織膠質細胞受到應激、缺氧等損傷信號的作用，p53水平首先增加，從而提高P-gp的表達，以抵抗損傷的影響，但是P-gp的增加卻導致了癲癇耐藥；當損傷刺激反復并達到細胞難以修復時，則p53誘導細胞凋亡，而星形膠質細胞凋亡，則其對神經細胞的保護、營養(yǎng)修復作用減弱，這都導致了難治性癲癇的形成。

本實驗把p53對P-gp和凋亡的作用聯(lián)系起來，可能反映了以p53為調控通路的癲癇動態(tài)變化，同時我們發(fā)現(xiàn)以上變化發(fā)生在膠質細胞，所以膠質細胞在癲癇的作用及是否可以通過調控膠質細胞功能協(xié)同治療癲癇值得深入研究。

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[5] 王 萍,王 偉,徐運蘭,等.大鼠腦缺血再灌注后神經元和星形膠質細胞凋亡的比較研究[J].中國組織化學與細胞化學雜志,2006,16:113-118.

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