苯酚在實驗紅鯽C1HD系體內(nèi)富集的實驗研究

董先輝，張朝暉，梁世杰，高麗君，朱曉娟，吳端生

1.南華大學藥學與生命科學學院，湖南衡陽 421001

2.南華大學公共衛(wèi)生學院，湖南衡陽 421001

苯酚是重要的有機化工原料，用它可制取酚醛樹脂、己內(nèi)酰胺、雙酚A、水楊酸、苦味酸、五氯酚、2，4-D、己二酸、酚酞n-乙酰乙氧基苯胺等化工產(chǎn)品及中間體，在化工原料、烷基酚、合成纖維、塑料、合成橡膠、醫(yī)藥、農(nóng)藥、香料、染料、涂料和煉油等工業(yè)中有著重要用途[1]。

在中國苯酚作為產(chǎn)品或中間產(chǎn)物的大量使用，使其成為地表水中的第一大類水體污染物，對水生生態(tài)環(huán)境存在一定的生態(tài)風險[2]。苯酚屬細胞原漿型毒物，低質(zhì)量濃度下可使蛋白質(zhì)變性，高質(zhì)量濃度時使蛋白質(zhì)凝固，為神經(jīng)性毒劑。水體環(huán)境中的苯酚對水生生物尤其是魚類危害嚴重，不僅可造成魚蝦發(fā)生急性中毒死亡，而且易在水生生物體內(nèi)富集影響水產(chǎn)品的品質(zhì)[3]，富集的苯酚隨食物鏈遷移將存在危害人體健康的風險。為了尋找檢測水環(huán)境毒物毒性水平的新方法，探討實驗紅鯽作為模式動物用于水環(huán)境污染物檢測和化學品毒性試驗的可行性，本文觀察了苯酚在實驗紅鯽C1HD系體內(nèi)的富集和解富集過程。

1 試驗材料及儀器

1.1 苯酚

苯酚（C6H6O，phenol）又名石碳酸，羥基苯，分子式為C6H5OH，呈弱酸性，熔點為43℃，沸點為181.9℃，相對密度為1.0576，常溫下微溶于水，易溶于有機溶劑，腐蝕性極強，在空氣中易被氧化而常呈粉紅色[4]；本實驗用分析純苯酚購于湖南匯虹試劑有限公司。

1.2 其他藥品或試劑

三氯甲烷、氯化銨、氨水，分析純，均購于湖南匯虹試劑有限公司；4-氨基安替比林，分析純，購于天津市光復(fù)精細化工研究所；鐵氰化鉀，分析純，購于長沙市分路口試劑化工廠。

1.3 主要儀器

250ml分液漏斗，功率可調(diào)電熱爐。250ml全玻璃蒸餾器，紫外可見分光光度計（SHIMADZU UV2450），10mm光程比色皿。

1.4 實驗動物

實驗紅鯽C1HD系，為本實驗室培育并提供。

2 方法

2.1 實驗紅鯽飼養(yǎng)方法

試驗用水為曝氣3d的自來水pH值6.54、溶氧量6.21mg/L、水溫（20±4）℃。水中不含苯酚。試驗用魚為馴養(yǎng)2周以上，7d內(nèi)死亡率為0%。采用半靜態(tài)式飼養(yǎng)方式，每天定時換入一半體積新鮮飼養(yǎng)用水。清除階段將在吸收試驗所用紅鯽放置在無酚水中繼續(xù)飼養(yǎng)?？瞻讓φ战M，一直飼養(yǎng)在無酚水中。試驗期間不進行喂食及增氧泵增氧。每天定時測定飼養(yǎng)環(huán)境溫度、pH值及溶氧量等參數(shù)。每隔四天從各濃度組平衡樣中隨機抽取2尾摘取內(nèi)臟組織，用于分析。

2.2 96h LC50測定及試驗濃度分組

96hLC50試驗方法參考文獻[5]。根據(jù)96 h LC50設(shè)置LC50/10、LC50/100兩個苯酚濃度組及空白對照組，各濃度組設(shè)置兩個平行樣。

2.3 苯酚的提取及濃度測定

解剖紅鯽摘取內(nèi)臟，無酚水清洗去除雜質(zhì)，濾紙擦干后稱重，勻漿器混合研磨內(nèi)臟組織（腸、心、肝胰臟等）至勻漿狀態(tài)，無酚水定容至100mL。水中苯酚提取及測定參考中華人民共和國國標GB7490-87：水質(zhì)揮發(fā)酚的測定采用蒸餾后4-氨基安替比林分光光度法[6,7]。

2.4 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差表示，分組之間用t檢驗。

3 結(jié)果

3.1 苯酚對紅鯽的96 h LC50

實驗得到各苯酚濃度組紅鯽致死情況如表1所示。直線內(nèi)插法求得96hLC50為37.02mg/L。以此設(shè)置兩個實驗濃度組LC50/1000.3702mg/L和LC50/103.702mg/L。

表1 紅鯽96 h死亡情況

3.2 苯酚在紅鯽體內(nèi)的富集含量

苯酚在紅鯽體內(nèi)的富集動態(tài)變化見表2。32d時LC50/100和LC50/10濃度組富集穩(wěn)定態(tài)苯酚含量分別為0.7998±0.0088mg/g，1.4095±0.0039mg/g。LC50/100濃度組要比LC50/10提前進入富集穩(wěn)定態(tài)。LC50/100和LC50/10濃度組苯酚吸收速率常數(shù)K1分別為0.03333mg/gd，0.04405mg/gd。富集達到穩(wěn)定態(tài)一半濃度需要時間分別為11.39d，10.71d。經(jīng)t檢驗試驗期最終穩(wěn)定態(tài)含量,兩組內(nèi)臟組織苯酚含量差異顯著(P＜0.05)，這表明內(nèi)臟組織內(nèi)苯酚含量隨水中濃度升高而升高。

表2 苯酚在紅鯽內(nèi)臟組織的積累（X±SD）

BCFss穩(wěn)定態(tài)生物富集系數(shù)(steaty state bioconcentration factor)=單位質(zhì)量組織含酚量/水酚濃度；T:富集至穩(wěn)定態(tài)受試物含量50%所用時間；K1=吸收速率常數(shù)(uptake rate constant)。

3.3 苯酚從紅鯽體內(nèi)的解富集過程

苯酚的解富集動態(tài)變化如表3所示。按Renfro（1973）方法[9]得LC50/100和LC50/10濃度組內(nèi)臟組織內(nèi)苯酚24d的殘留量分別為23.13%，13.57%；釋放率分別為76.87%，86.43%；解富集生物半衰期分別為：10.72d，10.14d；清除速率系數(shù)K2分別為：0.02851mg/gd，0.05638mg/gd。

表3 苯酚在紅鯽內(nèi)臟組織的解富集（X±SD）

4 討論

近年來，國內(nèi)外關(guān)于酚類物質(zhì)對于魚類急性毒性作用及分子毒理學方面的研究有較多的報道，但較少有酚類物質(zhì)在魚類體內(nèi)富集的實驗研究的報道。1977年湖北長江水產(chǎn)研究所做過酚在魚體內(nèi)積聚及消除的研究[10]及2001年魏愛泓等研究過鯉對酚的積累、分配和釋放[3]。后者設(shè)置0.005mg/L，0.025mg/L，0.05mg/L3個濃度組，分別對應(yīng)的在肌肉組織內(nèi)的富集濃度為0.3982±0.063mg/kg，0.7531±0.081mg/kg，1.0921±0.39mg/kg， 與本實驗結(jié)果相差較大,主要在于不同的處理濃度。這也說明在魚體內(nèi)的最終富集含量與魚生存的水環(huán)境苯酚的濃度直接相關(guān),水環(huán)境中苯酚含量越高最終富集穩(wěn)定態(tài)苯酚含量越高。根據(jù)魏愛泓的研究，在解富集的過程，生物半衰期隨著水環(huán)境苯酚濃度的增加逐漸延長，分別為5.52d，8.03d，13.90d，比較本實驗的高濃度組為10.14d和低濃度組為10.72d，也相差較大，分析原因可能是魚體內(nèi)不同組織解富集的方式有很大的區(qū)別，且與富集含量相關(guān)性較高。一方面，內(nèi)臟組織的解富集在本實驗設(shè)置的濃度范圍內(nèi)生物半衰期相差不大，這可能是由于內(nèi)臟組織代謝較旺盛且與水環(huán)境更加貼近從而更利于富集化學品的清除，至于在更寬的濃度范圍是否生物半衰期有所改變，還需要進一步實驗驗證；另一方面，內(nèi)臟組織生物半衰期相比較肌肉組織較長，分析可能是在較高富集含量時，魚自身防御能力提高新陳代謝，致使清除苯酚能力提高，降低了生物半衰期，即在一定范圍內(nèi)生物半衰期隨苯酚富集含量的提高會有所降低。

全球苯酚需求的年均增長率將達到4%～5%，2006年苯酚需求量就達到了800萬t。2004年，我國苯酚生產(chǎn)能力為74.0萬t/a，產(chǎn)量約41.0萬t，近年國內(nèi)苯酚消費量以每年約9%的速度在遞增[11]。本文通過探討不同濃度苯酚在紅鯽C1HD系體內(nèi)的富集、解富集的規(guī)律，得出苯酚在魚體內(nèi)的動態(tài)富集穩(wěn)定態(tài)含量、富集系數(shù)，解富集殘留量，釋放率及生物半衰期等參數(shù)，這將為漁業(yè)水質(zhì)監(jiān)測及水產(chǎn)品質(zhì)量保證提供了參考數(shù)據(jù)。

水生動物中魚類具有某些獨特的生物學特性，可以用于胚胎學、遺傳學等基礎(chǔ)醫(yī)學以及實驗動物醫(yī)學，比較醫(yī)學，環(huán)境毒理學，化學品毒性檢測等應(yīng)用性研究[12]。作為實驗魚類，國外已有斑馬魚（Danio rerio）、青鳉（Oryzias latipes）等10余種。我國還沒有本土標準化的實驗魚類正式注冊。目前已培育出“準”標準化的實驗魚類僅僅只有中國水產(chǎn)科學院珠江水產(chǎn)所培育的實驗劍尾魚（Xiphophorus helleri）、中國科學院水生生物研究所培育的稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）和本實驗室培育的實驗紅鯽（Carassius auratus red variety）。紅鯽C1HD系用于環(huán)境毒理學研究，一方面，其體型比國際通用實驗斑馬魚較大而更有利于富集含量較低，污染物濃度較低或檢測限較高化學品的檢測；另一方面，其生長生存能力較強，更利于毒性較強化學品或污染程度較高水域毒性研究。這些獨特的優(yōu)勢表明實驗紅鯽是一種很有開發(fā)價值的毒理學實驗動物。

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