蘆薈多糖檢測方法探索

文│云南萬綠生物股份有限公司 劉婭

蘆薈是一種含有較為豐富的營養(yǎng)物質(zhì)的天然植物，其生物活性成份復(fù)雜多樣，主要含有多糖、蘆薈苷、氨基酸、有機(jī)酸、維生素等多種營養(yǎng)成分。蘆薈多糖是一類具有不同生理功能的多糖大分子化合物，主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖等組成，以甘露糖為主，在凝膠干物質(zhì)中占5%以上。多糖是蘆薈中的主要成分，具有抗感染、抗癌、保肝、增強(qiáng)免疫力等功效，已廣泛應(yīng)用于食品、保健食品、化妝品、醫(yī)藥品等領(lǐng)域。蘆薈多糖是蘆薈制品的主要特征之一，產(chǎn)品中蘆薈多糖含量在一定范圍內(nèi)越高，則產(chǎn)品質(zhì)量越好，反之則質(zhì)量越差。另外也說明其加工工藝不合理，需近一步改進(jìn)。蘆薈多糖含量與蘆薈品種、生長環(huán)境及生長期等因素有關(guān)。蘆薈多糖含量的檢測方法也是近年來探索蘆薈功能性指標(biāo)的熱點(diǎn)之一。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純，所用水均為蒸餾水或去離子水。

庫拉索蘆薈、可見紫外分光光度計(jì)（UV759）、分析天平、電子萬用爐、離心機(jī)、電子恒溫干燥箱、移液管、容量瓶、燒杯。

95%乙醇、葡萄糖（分析純）、苯酚、鋁片、碳酸氫鈉、濃硫酸。

1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液制備：精確稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖100mg，置100mL容量瓶中，加水溶解至刻度（可加幾滴甲苯或幾粒苯甲酸防腐）。此標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00mL含葡萄糖1.00mg。

1.3 苯酚液制備：取苯酚100g，加鋁片0.1g，碳酸氫鈉0.05g，蒸餾收集182℃餾分，稱取此餾分10.0g，加水150g，置棕色瓶中備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 庫拉索蘆薈凝膠脫色汁制備方法：蘆薈鮮葉→清洗→去皮→打漿均質(zhì)→降解→脫色→過濾制得蘆薈凝膠脫色汁。

2.2 庫拉索蘆薈全葉汁制備方法：蘆薈鮮葉→清洗→打漿均質(zhì)→降解→過濾制得蘆薈全葉汁。

2.3 蘆薈多糖測定方法，參照QB/T2489的方法。

2.3.1 測定方法及步驟

2.3.1.1 測定原理

選用95%乙醇提取以除去單糖、低聚糖、苷類及生物堿等干擾成分，然后用去離子水提取其中所含的多糖類成分。多糖在硫酸的作用下，水解生成戊糖、己糖和糖醛酸等單糖，并迅速脫水水解生成糖醛衍生物，與苯酚縮合成有色化合物，在490nm處有吸收峰，吸收值與糖含量呈線性關(guān)系，用分光光度計(jì)測定。

2.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.25，0.5，1.00，2.00，2.50mL，分別置于50mL容量瓶中，加水定容。吸取上述溶液各2.00mL，再加苯酚液1.00mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.00mL，搖勻后放置5min，置沸水浴中加熱15min，取出后冷卻至室溫，于490nm處以水作參比測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得回歸方程如下：

2.3.1.3 蘆薈待測樣品預(yù)處理

液體樣品：將樣品混勻后備用。

固體樣品：稱取1.0000g樣品粉末，加1.5mL甲醇潤濕，加60℃熱水超聲波萃取30分鐘后，至樣品完全溶解，用去離子水定容至100mL，搖勻，備用。

準(zhǔn)確吸取樣品液10mL加入9倍體積的95%乙醇在4℃下靜止沉淀12小時(shí)（放置過夜），以4000r/min旋轉(zhuǎn)速度離心20分鐘，棄去上清液，將沉淀物用（60±2℃）的熱水50mL充分溶解，并用10mL（60±2℃）熱水洗滌離心管三次，洗液并入容量瓶，放冷后定容至刻度，備用。

2.3.1.4 樣品中多糖含量測定

吸?。?）制備的樣品液2.00mL，置于10mL容量瓶中，加水定容。吸取2.00mL上述溶液，再加苯酚液1.00mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.00mL，搖勻后放置5min，置沸水浴中加熱15min，取出后冷卻至室溫，于490nm處以去離子水作參比測吸光度。另以2.00mL水，同上操作做空白。查標(biāo)準(zhǔn)曲線得樣品液中葡萄糖含量（μg/mL）

2.3.1.4 結(jié)果分析計(jì)算

固體樣品X（mg/100g）＝〔（c1-c2）×D×V5× V0×100〕/ （V4× G×1000）＝〔（c1-c2）×D×V5× V0〕/ （V4× G×10）

液體樣品X（mg/100mL）＝〔（c1-c2）×D×V5×100〕/（V4×1000）＝〔（c1-c2）×D×V5〕/（V4×10）

式中：x－樣品中多糖含量（以葡萄糖計(jì)），mg/100g或mg/100mL

c1－從濃度＿吸光度曲線上查得樣品溶液的葡萄糖濃度，μg/mL

c2－從濃度-吸光度曲線上查得空白溶液的葡萄糖濃度，μg／mL

V0-為固體樣品處理時(shí)所定容的體積，mL，如本法為100

V4－乙醇沉淀時(shí)所移樣品的體積，mL，如本法為10

V5－待測樣品多糖溶液定容體積，mL，如按本方法為100

G－稱取固體樣品的質(zhì)量，g

D－稀釋倍數(shù)，如按本方法為5

2.3.2 平行測定兩次，如果其結(jié)果符合允許差時(shí)，取兩次測定結(jié)果的算術(shù)平均值作為結(jié)果，報(bào)告結(jié)果取三位有效數(shù)字。

3 穩(wěn)定性、重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

為了評(píng)價(jià)所用方法的穩(wěn)定性及重現(xiàn)性，按操作方法對樣品庫拉索蘆薈凝膠脫色汁及全葉汁處理后，重復(fù)比色6次，測定吸光度，計(jì)算其多糖含量，結(jié)果如下表格：

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，此種方法的RSD小于1%，測量的誤差都較小，精密度也好，因此，用分光光度法測定蘆薈中多糖含量是比較可行的，具有一定的實(shí)際意義。

4 結(jié)果與討論

制備苯酚液時(shí)，棄去開始幾滴及最后的蒸餾液，苯酚液濃度影響多糖顯色。所用的分析純或優(yōu)級(jí)純硫酸，應(yīng)無黑色殘?jiān)爱愇?，否則影響測定結(jié)果。滴加濃硫酸時(shí)應(yīng)小心沿比色管內(nèi)壁慢慢滴加，防止反應(yīng)過激烈傷害到自己及他人。樣品滴加硫酸及苯酚后都應(yīng)充分搖勻，使其反應(yīng)充分，其反應(yīng)正常顏色呈橘黃色。為使誤差在允許范圍內(nèi)，一般要求其吸光度在0.2～0.8之間最適宜，這樣盡可能減少誤差。

該方法不僅操作簡單、快速省時(shí)、準(zhǔn)確度較高、結(jié)果重現(xiàn)性好，可廣泛用來測定蘆薈制品中多糖含量。

樣品編號(hào) 空白溶液吸光度樣品溶液吸光度樣品多糖含量（mg/100g） 平均值 標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）凝膠脫色汁1 0.012 0.339 94.67 95.30 0.54 0.0056凝膠脫色汁2 0.343 95.82凝膠脫色汁3 0.341 95.25凝膠脫色汁4 0.339 94.67凝膠脫色汁5 0.341 95.26凝膠脫色汁6 0.344 96.11全葉汁1 0.013 0.472 132.88 132.69 0.79 0.0060全葉汁2 0.469 132.01全葉汁3 0.475 133.75全葉汁4 0.471 132.59全葉汁5 0.467 131.43全葉汁6 0.474 133.46