新生大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)及膜片鉗全細胞記錄＊

徐祖才，徐 平，張 駿，雷顯澤，徐忠祥，王學(xué)峰

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 400016；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州遵義563003）

原代培養(yǎng)的神經(jīng)元已經(jīng)成為神經(jīng)學(xué)科領(lǐng)域的同行們最常用的實驗對象之一，因此，神經(jīng)元的原代培養(yǎng)方法日漸增多。隨著神經(jīng)電生理實驗技術(shù)的迅速發(fā)展，特別是膜片鉗技術(shù)在神經(jīng)學(xué)科的應(yīng)用以來，對原代培養(yǎng)的神經(jīng)元狀態(tài)要求越來越高，本實驗在參照文獻［1－4］的培養(yǎng)方法基礎(chǔ)上稍作改進，培養(yǎng)出細胞膜上各離子通道功能良好的且適應(yīng)于膜片鉗全細胞記錄的海馬神經(jīng)元，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物與主要實驗儀器 1d內(nèi)新生Wistar大鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；SW－CJ－2FD型超凈工作臺購自蘇凈集團安泰公司，細胞培養(yǎng)箱購自美國Thenno Fonna，細胞培養(yǎng)板購自美國Costar，TE2000－U倒置相差顯微鏡購自日本Nikon；TDZ5－WS多管架自動平衡離心機購于長沙湘儀離心機儀器有限公司，TCS－SP2型激光共聚焦掃描顯微鏡購自德國Leica，NVSLM1型振動切片機購自英國Campden，電極拉制儀（P－97）購自美國，玻璃微電極管（外徑1.0mm）購自南京六合泉實驗器材廠，膜片鉗系統(tǒng)購自美國Axon。

1.1.2主要試劑 神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Neurobasal media）、B－27、L－谷胺酰胺及特級胎牛血清購自美國Gibco公司。種植液組成：神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、2%B－27（體積比）、0.5μmmol/L L－谷胺酰胺及10%胎牛血清；維持液：神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、2%B－27（體積比）和0.5μmmol/L L－谷胺酰胺。D－Hanks和多聚－L－賴氨酸購于美國Sigma公司，胰蛋白酶由上海佰奧生物科技有限公司提供，小鼠抗NeuN一抗購自美國 Millipore、兔抗小鼠FITC二抗由北京中杉公司分裝，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供10%水合氯醛。人工腦脊液（Artificial cerebrospinal fluid，ACSF）配方及各成分濃度：NaCL 124mmol/L，KCL 3 mmol/L，CaCL22mmol/L，MgCL22mmol/L，NaH2PO41.23 mmol/L，NaHCO326mmol/L和葡萄糖10mmol/L；電流鉗模式下記錄動作電位的電極內(nèi)液配方及各成分濃度：K2SO460 mmol/L，N－甲基－D－葡糖胺（NMG）60mmol/L，4－羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）40mmol/L，MgCl24mmol/L，四乙酸（BAPTA）0.5mmol/L，磷酸肌酸（phosphocreatine）12mmol/L，Na2ATP 2mmol/L 和 Na3GTP 0.2mmol/L；電壓鉗模式下記錄電流的極內(nèi)液成分和相應(yīng)濃度：KCL 140mmol/L，MgCL20.5 mmol/L，乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）2mmol/L，HEPES 5 mmol/L，K2ATP 4mmol/L，KOH將pH值調(diào)至7.2。

1.2方法

1.2.1海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng) 先在蓋玻片上涂抹0.1%多聚－L－賴氨酸，在超凈臺內(nèi)，經(jīng)紫外燈照射消毒后，放置在24孔細胞培養(yǎng)板孔內(nèi)備用。選擇1d內(nèi)的新生Wistar大鼠，迅速剝出全腦，移入0℃D－Hanks液中，分離雙側(cè)海馬并剪碎。加入0.125%胰蛋白酶（體積相當(dāng)于腦組織的5倍）并置于5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)消化20～30min，后加入相同體積的種植液并維持5min以終止消化。1 000r/min離心5min，棄上清液，加入種植液，使用拋光冷卻后的巴氏管輕柔吹打，制成細胞懸液，使用200目篩網(wǎng)過濾，經(jīng)計數(shù)后，以種植液稀釋成5×105/mL的細胞懸液，24孔細胞培養(yǎng)板的每孔按1mL懸液進行接種，置入5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1d即全液更換維持液培養(yǎng)，后每間隔3d更換一半培養(yǎng)液。

1.2.2免疫熒光技術(shù)鑒定神經(jīng)元 神經(jīng)元核抗原（Neuronal nuclei，NeuN）是神經(jīng)元細胞核中的一種特異性蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是成熟神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物［5］。神經(jīng)元培養(yǎng)至第10天時，進行細胞爬片，放置載玻片上，經(jīng)4%多聚甲醛固定30min后，PBS清洗5min×3次，10%山羊血清封閉液常溫下處理30min，后傾去血清，加入小鼠抗NeuN抗體（稀釋比例1∶100），置4℃冰箱過夜。次日，取出后常溫放置2h，PBS清洗5 min×3次，避光加山羊抗小鼠FITC（稀釋比例1∶50），常溫2 h后，PBS清洗5min×3次，50%甘油封片備用，擇期在激光共聚焦掃描顯微鏡下拍照。

1.2.3膜片鉗全細胞記錄 參照文獻［6］的方法，將備用的細胞爬片轉(zhuǎn)移入浴槽中，使用輸液泵持續(xù)向浴槽灌注95%O2＋5%CO2混合氣飽和的ACSF，浴槽流出端使用蠕動泵將液體以3～4mL/min恒速泵出，調(diào)整輸液泵至細胞在液面下1～2 mm為適。P－97微電極拉制儀拉制記錄微電極（直徑1～2 μm），電極內(nèi)液使用0.2μm的微孔濾膜濾過后充灌電極，充灌電極內(nèi)液后入水電阻2～4MΩ。選擇表面光滑且透光度好的狀態(tài)良好的神經(jīng)元進行實驗，封接成功后，抽吸破膜即可形成全細胞記錄。在電流鉗模式下，記錄自發(fā)性動作電位（action potential，AP）；在電壓鉗模式下記錄自發(fā)性興奮性突觸后電流（spontaneous excitatory postsynaptic current，sEPSC），信號采集分析均由pClamp 9.2軟件完成。

2 結(jié) 果

2.1海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察 神經(jīng)元在1d后更換全液，此時在倒置相差顯微鏡下觀察，神經(jīng)元貼壁穩(wěn)定，且背景較干凈，部分神經(jīng)元可見較短突起長出（封2圖1A）；3d后，神經(jīng)元突起明顯變長變多，且細胞體輪廓清晰，呈錐形（封2圖1B）；至第10天時，神經(jīng)元形態(tài)特征明顯，細胞體表面光滑，透光度好，可見細胞周圍明顯光暈，突起增多增長且細出現(xiàn)分支，從而形成明顯的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（封2圖1C、D）。

圖3 膜片鉗全細胞記錄

2.2NeuN鑒定海馬神經(jīng)元 NeuN免疫熒光染色，激光共聚焦掃描顯微鏡下可見神經(jīng)元細胞核著綠色，細胞質(zhì)和突起不著色，最終發(fā)現(xiàn)本方法所培養(yǎng)的神經(jīng)元純度可達100%，見封2圖2。

2.3膜片鉗全細胞記錄 在電流鉗模式下，可記錄到神經(jīng)元的偶爾自發(fā)性AP，膜電位在－65.2mV左右（圖3A）；在電壓鉗模式下，可以記錄到神經(jīng)元的sEPSC（圖3B）。

3 討 論

海馬是整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)對缺血、缺氧、炎癥等各種損傷耐受能力最差的部位之一，且所含神經(jīng)元密度高，非神經(jīng)元細胞相對較少，因此，海馬常常被作為神經(jīng)元原代培養(yǎng)的首選部位。作者闡述了1d內(nèi)鼠齡的Wistar大鼠海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)方法，在培養(yǎng)1d后細胞基本貼壁；3d開始細胞體逐漸豐滿，突起開始變長；到達第10天時，神經(jīng)元已經(jīng)成熟，細胞體形態(tài)特征明顯，立體感強，表面光滑，透光度良好，周圍光暈明顯，突起豐富且細胞與細胞之間形成明顯的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。通過神經(jīng)元特異性核抗原NeuN及FITC標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)所培養(yǎng)的神經(jīng)元純度高。為了檢測神經(jīng)元的電生理特征是否完好，通過膜片鉗全細胞記錄，發(fā)現(xiàn)細胞封接順利，在電流鉗模式下可以記錄到偶爾自發(fā)性AP，在電壓鉗模式下可以記錄到sEPSC，從而證實了細胞膜以及突觸傳遞功能良好，適合膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用。

針對神經(jīng)元原代培養(yǎng)的實驗對象選擇上，目前除了本實驗選擇的新生鼠外，還可以選用胎鼠，但由于胎鼠的胎齡不易掌控，并且胎鼠的海馬剝離困難且體積偏小，而使得該方法的推廣遇到了瓶頸［7］。在培養(yǎng)方法上，有選擇普通培養(yǎng)基，外加抑制細胞有絲分裂的藥物阿糖胞苷，然而，該藥物的使用量較難控制，過量時，在抑制膠質(zhì)細胞的繁殖和生長的同時，對神經(jīng)元的正常生長也有一定的毒副作用，從而影響其活性，達不到實驗需求，量不夠時，則不能很好地抑制膠質(zhì)細胞的增殖［8］。本實驗直接選用神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基及B－27添加劑，能夠抑制非神經(jīng)元的生長而更有利于神經(jīng)元的生長，從而可以提高神經(jīng)元的純度，此外，該組合的培養(yǎng)基中含有多種抗氧化劑，具有保護神經(jīng)元的作用，從而保證神經(jīng)元的最終活性［9］。

隨著神經(jīng)學(xué)科的快速發(fā)展，海馬神經(jīng)元及膜片鉗技術(shù)有機結(jié)合在神經(jīng)生理功能及病理狀態(tài)的應(yīng)用方興未艾，如興奮性氨基酸神經(jīng)毒性［10］、缺氧性損傷［11］、癲癇［12－14］和單純皰疹病毒性腦炎［15］等。本實驗所提供的海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法，可為膜片鉗技術(shù)的順利應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)。

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