鴨黃病毒的分離鑒定

陳仕龍，陳少鶯＊，王 劭，李兆龍，程曉霞，林鋒強(qiáng)，朱小麗，江 斌，黃梅清，鄭 敏，毛 寧

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013）

2010年9月，福建省長樂某蛋鴨養(yǎng)殖場出現(xiàn)一種產(chǎn)蛋鴨發(fā)熱、產(chǎn)蛋顯著下降、采食減少、后備小鴨頭頸歪斜、軟腳為主要特征的疾病。剖檢主要表現(xiàn)為腦殼出血、卵泡出血、萎縮，部分卵黃破裂，形成卵黃性腹膜炎。為明確病因，福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動物病毒研究室（以下稱本實(shí)驗(yàn)室）在該場發(fā)病鴨病料中分離到一株病毒，經(jīng)分離毒的部分理化特性分析、動物回歸、RT－PCR等測定，證實(shí)分離毒是導(dǎo)致該場疾病的病原，屬于黃病毒科黃病毒屬的鴨黃病毒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集及處理 病料來源于2010年福建省長樂某蛋鴨養(yǎng)殖場。無菌采集減蛋蛋鴨的肝、脾、胰腺、卵泡、輸卵管、卵巢等組織，經(jīng)接種鮮血瓊脂平板后，剪碎研磨，以Hank＇s液制成1∶5勻漿，加雙抗各1000單位，4℃過夜，凍融3次，6000r／min離心20min，取上清液為病毒分離的病料。

1.1.2 病毒、血清及禽胚 雞黃病毒分離株CJD05由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定、保存。雞抗雞黃病毒陽性血清，由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。11日齡番鴨胚購自福州山區(qū)健康番鴨場；SPF雞胚購自福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司，并孵化至9日齡。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 取病料處理物經(jīng)尿囊腔接種11日齡番鴨胚和9日齡SPF雞胚各4枚，0.1mL／枚，37℃孵育，每日觀察2次至第7天，棄去24h內(nèi)的死胚，死亡胚胎置4℃冰箱4h以上，剖檢、觀察病變，收獲胚胎和胚液，在－70℃凍存或傳代。

1.2.2 分離毒的血凝特性 按文獻(xiàn)[1]進(jìn)行，在37℃、pH7.2的PBS中測定尿囊液分離毒對雞、鴿紅細(xì)胞的血凝性。

1.2.3 分離毒的毒價及中和試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[2]，取第4代番鴨胚尿囊液病毒液用Hanks液作10倍系列稀釋，每一稀釋度各接種4枚11日齡番鴨胚，37℃ 孵育，觀察7d，按 Reed－Muench 法計算ELD50。取等體積的200ELD50病毒液與一系列倍比稀釋的雞抗雞黃病毒陽性血清充分混合，37℃作用1h后接種9日齡SPF雞胚，每個稀釋度接種4枚，0.1mL／枚，37℃ 孵育7d，棄去24h內(nèi)的死胚，統(tǒng)計雞胚死亡情況，按Reed－Muench法計算中和效價。

1.2.4 分離毒的RT－PCR鑒定 根據(jù)本研究室以禽黃病毒3＇端基因通用引物建立的RT－PCR檢測方法（內(nèi)部資料，待發(fā)表），提取分離毒尿囊液及雞黃病毒分離株CJD05的核酸，進(jìn)行RT－PCR檢測，擴(kuò)增目的片段大小為708bp。

1.2.5 分離毒的人工感染試驗(yàn) 對產(chǎn)蛋高峰的蛋鴨口服、肌注、點(diǎn)眼等方式感染番鴨胚第4代尿囊液病毒，1.0mL／羽，共10羽；同時設(shè)對照組，每羽注射滅菌Hanks液，1.0mL／羽，共10羽。隔離試驗(yàn)，每天觀察采食、飲水及產(chǎn)蛋等性能，連續(xù)觀察數(shù)天，并在試驗(yàn)結(jié)束時攻毒組和對照組各取4羽剖殺，觀察剖檢病變并采集病料進(jìn)行病毒分離和RT－PCR鑒定。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

取典型發(fā)病鴨的血、肝、脾、輸卵管等組織接種鮮血瓊脂平板培養(yǎng)7d，均未分離到細(xì)菌。

2.2 病毒分離

病料接種番鴨胚和SPF雞胚尿囊腔，均能致死雞胚和番鴨胚，于接種后72h～120h死亡，在胚肝中有出血、壞死病變，尿囊液清亮，分離毒命名為DJD09。

2.3 分離毒血凝性測定

第1～3代尿囊液分離毒在37℃、pH7.2條件下不能凝集鴿子、雞的紅細(xì)胞，說明分離毒不是副黏病毒、禽流感病毒或減蛋綜合癥病毒。

2.4 分離毒的毒價及中和特性

第4代番鴨胚尿囊液分離毒在番鴨胚中的ELD50為104.0／0.1mL。分離毒能被雞黃病毒陽性血清所特異中和，中和效價為1∶64，證實(shí)分離毒類似雞黃病毒。

2.5 RT－PCR 鑒定

分別以雞黃病毒CJD05及分離毒DJD09核酸作為模板，進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出與預(yù)計大小相符的片段，進(jìn)一步證實(shí)分離毒為禽黃病毒中的鴨黃病毒（圖1）。

圖1 RT－PCR擴(kuò)增的電泳圖Fig.1 The results of RT－PCR detection

2.6 人工感染試驗(yàn)

取分離毒DJD09人工感染產(chǎn)蛋高峰的蛋鴨，能復(fù)制出與自然病例一致的臨床癥狀和剖檢病變，表現(xiàn)為攻毒后第4天開始產(chǎn)蛋、采食逐漸減少；直到攻毒后12d，產(chǎn)蛋停止，食欲廢絕。隨機(jī)處死4只，見卵泡充血、出血、萎縮和變形；其中2羽卵泡破裂，形成卵黃性腹膜炎，輸卵管壁出血，人工感染組產(chǎn)蛋率明顯低于對照組，并能從攻毒鴨內(nèi)臟中重新分離到病毒，且禽黃病毒RT－PCR檢測為陽性。

3 討論

鴨黃病毒病是流行于我國的一種新型黃病毒病，最早出現(xiàn)于1995年的河北省石家莊、邯鄲等地，溫立斌等[3]首次鑒定該病的病原為黃病毒科的鴨病毒性腦炎病毒，國外未見報道。2010年，該病在我國多個省、市大面積流行，給我國養(yǎng)鴨業(yè)，特別是蛋鴨養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病主要以多品種鴨腳麻痹、頭頸歪斜等運(yùn)動機(jī)能失調(diào)的神經(jīng)癥狀，產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋急降、出血性卵巢炎為特征[3－8]。臨床上非常容易與禽流感、新城疫等疾病相混淆，確診必須依靠實(shí)驗(yàn)室診斷 。

本研究從臨床表現(xiàn)為產(chǎn)蛋下降和神經(jīng)癥狀為特征的發(fā)病鴨中分離到一株病毒，病毒無血凝性，能致死雞胚及番鴨胚，能被雞黃病毒陽性血清特異中和；RT－PCR檢測中，分離毒核酸能被禽黃病毒引物所特異擴(kuò)增；病毒回歸能導(dǎo)致與臨床相類似的癥狀；表明分離毒為近年來危害我國養(yǎng)鴨業(yè)的鴨黃病毒。鴨黃病毒病病原的明確，為該病的深入研究提供了基礎(chǔ)。

鴨黃病毒屬于黃病毒科、黃病毒屬、蚊傳播病毒的恩塔亞病毒群，和該群中的Tembusu病毒親緣關(guān)系最近[4，8]。本研究組分離到的雞源黃病毒（導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋急降）、鴨源黃病毒與國內(nèi)其他學(xué)者公布的鴨黃病毒分離株基因高度同源[9]，雞黃病毒陽性血清能夠中和鴨黃病毒分離株。黃欣梅等[10]報道，從鴨、鵝產(chǎn)蛋率、采食量下降中分離的鵝黃病毒也與Tembusu病毒基因序列有很高的同源性。推測近年來流行于我國的雞、鴨、鵝黃病毒病很可能是同一種病毒，他們之間有著相同的起源及進(jìn)化。鑒于不同學(xué)者對該病的命名不同，應(yīng)該盡早規(guī)范該病的命名，在業(yè)內(nèi)統(tǒng)一該病的名稱。

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