豬偽狂犬疫苗研究進(jìn)展

劉濤，趙京媛，孫曉成

(1.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，天津 300300；2.河北省寧晉畜牧獸醫(yī)管理辦公室，河北邢臺(tái) 055550)

瑞普(( 保定))生物藥業(yè)有限公司

目前，疫苗接種是預(yù)防、控制甚至消滅豬偽狂犬病主要的措施之一。國(guó)內(nèi)外已研制出豬偽狂犬病的滅活疫苗、弱毒疫苗、基因缺失弱毒疫苗已經(jīng)相對(duì)成熟，而病毒載體重組疫苗、核酸疫苗、亞單位疫苗尚處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。本文對(duì)豬偽狂犬疫苗做簡(jiǎn)要綜述。

一、滅活疫苗

滅活疫苗是將豬偽狂犬病毒接種于雞胚或細(xì)胞，當(dāng)病毒滴度達(dá)到要求時(shí)收獲病毒，滅活后加入免疫佐劑，從而制成滅活疫苗。

1.滅活疫苗優(yōu)點(diǎn)。安全性高，不會(huì)引起散毒，也不會(huì)帶來(lái)潛伏感染的問(wèn)題。

2.滅活疫苗缺點(diǎn)。滅活疫苗不能將內(nèi)源性蛋白抗原提呈給免疫系統(tǒng)，因而不能誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞反應(yīng)(CTL)。皰疹病毒本身的免疫原性與毒力有一定的相關(guān)性，因此滅活疫苗的免疫 效果一般較差，并且滅活疫苗使用的免疫劑量較大，偶爾會(huì)發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，故在生產(chǎn)上已經(jīng)較少應(yīng)用。

二、自然缺失弱毒活疫苗

弱毒活疫苗是將分離到的野毒株經(jīng)非豬源細(xì)胞反復(fù)傳代，或適應(yīng)雞胚，或加入致突變劑在高于一般的培養(yǎng)溫度條件下，在細(xì)胞上反復(fù)傳代而獲得的疫苗，如匈牙利的Bartha株、羅馬尼亞的Bucharest株、BUK株、TK200株、北愛(ài)爾蘭的NIA4株、法國(guó)Alfort-26株、前蘇聯(lián)的VGNK-I株、保加利亞MK25株、南斯拉夫的Bkal68株和Govacc株等弱毒株。目前使用較多的是Bartha、Buk毒株。

我國(guó)目前廣泛使用的PR弱毒凍干疫苗(Bartha-k61)是一種gI／gE雙基因缺失弱毒疫苗，由于該基因缺失而進(jìn)一步阻斷弱毒株回復(fù)毒力的可能性，所以大大提高了這種弱毒苗的安全性。

1.自然缺失弱毒活疫苗的優(yōu)點(diǎn)。弱毒苗具有良好的免疫原性，而且價(jià)格低廉，至今仍在偽狂犬病的防控中起著重要的作用。

2.自然缺失弱毒活疫苗的缺點(diǎn)。未經(jīng)充分致弱的弱毒苗的毒力可能會(huì)返強(qiáng)而導(dǎo)致疾病的流行；弱毒疫苗可建立潛伏感染，并有可能散毒。

三、基因工程疫苗

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，豬偽狂犬病病毒的基因組結(jié)構(gòu)、基因缺失對(duì)病毒生物學(xué)性質(zhì)和免疫原性的影響得到了廣泛研究，豬偽狂犬基因工程疫苗的研究得到更深入的發(fā)展。豬偽狂犬基因工程疫苗包括：基因工程缺失弱毒活疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、重組病毒疫苗。

(一)基因工程缺失弱毒活疫苗豬偽狂犬基因缺失主要包括對(duì)與毒力相關(guān)的基因如TK、RR、gE、gl等基因的缺失以降低病毒毒力；對(duì)糖蛋白基因如gG、gC、gD等基因的缺失以引入選擇標(biāo)記或阻止感染性病毒的產(chǎn)生，從而致弱豬偽狂犬病毒，同時(shí)又保持其較強(qiáng)的免疫原性?；蚬こ倘笔б呙绲难兄剖加?0世紀(jì)80年代初。

1.第一代基因缺失疫苗。第一代基因缺失疫苗指缺失PRV一個(gè)主要的毒力基因獲得的疫苗。1984年，Kit等以PRV BUK為起始材料，并以BUK疫苗株為親本，通過(guò)缺失TK基因序列中的148bp片段，構(gòu)建出PRV的TK缺失株P(guān)RV BUK-d13株。試驗(yàn)證明，該疫苗對(duì)豬是安全的，并能提供有效的保護(hù)，5～6周齡豬在免疫接種后能產(chǎn)生中和抗體，在攻毒后能表現(xiàn)出再次免疫應(yīng)答。Quint等 對(duì) PRV NIA-3株 的US區(qū)進(jìn)行部分缺失(gE基因缺失)，構(gòu)建的PRV突變株能明顯降低PRV對(duì)小鼠和10周齡仔豬的毒力，可使免疫豬能抵抗強(qiáng)毒的致死攻擊。但該突變株對(duì)3日齡仔豬仍具有較強(qiáng)的毒力。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳煥春等構(gòu)建了PRV Ea株TK基因缺失株；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)郭萬(wàn)柱等構(gòu)建了PRV閩A株TK基因缺失株，免疫小鼠有一定的保護(hù)作用。TK基因缺失疫苗不僅能較好地免疫豬只，而且免疫豬后還可以通過(guò)PCR的方法將免疫接種豬與自然感染豬區(qū)分開(kāi)來(lái)。但是，由于TK基因?qū)儆诿傅鞍谆?，在體內(nèi)不能產(chǎn)生其相應(yīng)的抗體，因此僅缺失TK基因不能用血清學(xué)方法區(qū)別開(kāi)免疫接種豬與自然感染豬，要將此區(qū)別開(kāi)來(lái)必須缺失相應(yīng)的糖蛋白基因。鑒于此，許多學(xué)者在TK基因缺失的基礎(chǔ)上又缺失了相應(yīng)的糖蛋白基因而構(gòu)建了含TK基因缺失的雙缺失和多缺失疫苗株。

2.第二代基因缺失疫苗。第二代基因缺失疫苗除了在TK基因引入了一個(gè)缺失外，在非編碼必需糖蛋白的基因內(nèi)引入了一個(gè)新的缺失?；虿迦胍粋€(gè)報(bào)告基因，這樣得到的突變株就不能產(chǎn)生被缺失的糖蛋白，因而免疫動(dòng)物就不能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，因此可以通過(guò)血清學(xué)方法將免疫接種豬與自然感染野毒的豬相區(qū)別。這也是第二代基因缺失疫苗的最顯著特點(diǎn)。還值得注意的是有些糖蛋白的缺失，可以進(jìn)一步降低毒力。第一個(gè)申請(qǐng)專(zhuān)利并注冊(cè)使用的PRV基因工程疫苗OM-NIVACPRV就是TK基因缺失疫苗。在我國(guó)，陳煥春等在PRV Ea TK-株基礎(chǔ)上構(gòu)建了PRV Ea TK-/gG-、TK-/gE-疫苗株。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)的郭萬(wàn)柱等構(gòu)建了PRV閩A TK一／gC一、TK一／gE一等毒株。其中應(yīng)用較多的有TK一／gC一、TK一／gD一、TK一／gE一、TK－／gC一等雙缺失疫苗株和TK一／gE－／gG－三缺失疫苗株。經(jīng)增殖能力、安全性、毒力穩(wěn)定性和免疫原性測(cè)定結(jié)果表明，這些疫苗株具有較好的安全性；良好的遺傳穩(wěn)定性；很強(qiáng)的免疫原性。2003年郭萬(wàn)柱主持研制的豬偽狂犬病基因缺失活疫苗SA215株正式獲得國(guó)家新獸藥證書(shū)。致細(xì)胞病變效應(yīng)、安全性、免疫原性和接種動(dòng)物抗體消長(zhǎng)規(guī)律等生物學(xué)特性測(cè)定及田間試驗(yàn)結(jié)果顯示，SA215株是一株安全、免疫原性好的疫苗株。

近幾年，GFP作為報(bào)告基因而引起了廣泛的注意，該報(bào)告基因編碼綠色熒光蛋白，能自身催化形成發(fā)光結(jié)構(gòu)并在藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，因而是一種全新的報(bào)告分子。

上述基因缺失疫苗的構(gòu)建成功，為偽狂犬病的根除計(jì)劃打下了物質(zhì)基礎(chǔ)。除此之外，人們還將注意力集中在核苷酸還原酶(RR)、蛋白激酶(PK)、堿性酸外切酶、脫氧尿苷三磷酸激酶等與PRV毒力相關(guān)的基因上，試圖通過(guò)缺失這些基因，更進(jìn)一步地降低疫苗毒株的殘余毒力，從而使突變株更為安全。

(1)基因工程缺失弱毒活疫苗優(yōu)點(diǎn)：都缺失了目的基因的幾百甚至幾千個(gè)堿基，缺失區(qū)域明確，所以它們返祖的可能性極小。PRV缺失株一般都缺失了一個(gè)或幾個(gè)毒力基因，所以大多數(shù)PRV缺失株對(duì)鼠、豬無(wú)毒力或僅有較低的毒力，但是，僅缺失TK基因的弱毒株對(duì)犢牛還有較低的毒力，而對(duì)貓、狗毒力較強(qiáng)，若同時(shí)再缺失gC或gE基因，則幾乎不表現(xiàn)出毒力。大多數(shù)的PRV缺失疫苗株都有較強(qiáng)的免疫原性，免疫動(dòng)物都獲得了較強(qiáng)的保護(hù)力。強(qiáng)毒攻擊免疫豬只出現(xiàn)臨床癥狀和增重受阻，而豬只的排毒時(shí)間大大縮短，排毒量也大大降低。

(2)基因工程缺失弱毒活疫苗缺點(diǎn)：基因缺失疫苗能否引起潛伏感染或被激活為感染性病毒令人擔(dān)憂(yōu)?；蛉笔б呙缭趧?dòng)物體內(nèi)與野毒或不同的基因缺失疫苗間發(fā)生基因重組而突變成強(qiáng)毒株，從而成為新的傳染源，這種可能性是存在的?；蛉笔б呙缭诮臃N后也存在潛伏感染和排毒的問(wèn)題。

(二)亞單位疫苗 亞單位疫苗是利用PRV保護(hù)性抗原基因，在原核或真核系統(tǒng)中表達(dá)所獲得的產(chǎn)物制成的疫苗。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PRV有11種糖蛋白，其中，gB、 gC、gD均為刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的蛋白，所產(chǎn)生的抗體無(wú)論是在體內(nèi)、體外，還是在有無(wú)補(bǔ)體存在的情況下都有中和PRV的能力，因此，gB、gC、gD是研制PRV亞單位疫苗的首選糖蛋白。

Marchioli等將PRV保護(hù)性抗原基因gD插入到人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的下游，然后轉(zhuǎn)入中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中，經(jīng)氨喋呤篩選出1株表達(dá)gD蛋白的CHO gD-l7細(xì)胞株，經(jīng)大量培養(yǎng)后用表達(dá)產(chǎn)物配以佐劑，免疫小鼠能產(chǎn)生較高滴度的抗體，免疫3次后攻毒，小鼠能抵抗強(qiáng)毒攻擊。鼻內(nèi)接種免疫豬，能誘導(dǎo)豬產(chǎn)生中和抗體并保護(hù)豬抵抗PRV強(qiáng)毒的攻擊。Katayama等(1991)用肝素親和層析純化的gC和用免疫親和層析純化的gB、gC、 gD分別接種豬，均能使其抵抗PRV的攻擊。

1.亞單位疫苗的優(yōu)點(diǎn)。不含有核酸物質(zhì)因此比較安全，接種后不會(huì)產(chǎn)生持續(xù)感染或潛伏感染。產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可以與野毒感染相區(qū)分，有利于疫病的控制和消滅。

2.亞單位疫苗的缺點(diǎn)。生產(chǎn)成本高，免疫原性不及弱毒疫苗及滅活疫苗，應(yīng)用受到限制。

(三)核酸疫苗 核酸疫苗是指將編碼外源蛋白質(zhì)的核酸表達(dá)載體注射入機(jī)體，以激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)外源蛋白質(zhì)特異性的免疫應(yīng)答。Gerdts等將PRV gC或gD基因置于人巨細(xì)胞病毒的主要立即早期啟動(dòng)子下游構(gòu)建了DNA疫苗。用表達(dá)gC的核酸疫苗免疫能完全保護(hù)豬抵抗PRV-75V19毒株的致死性攻擊，并能保護(hù)豬部分抵抗PRV強(qiáng)毒NIA-3株的攻擊；但用表達(dá)gD的核酸疫苗免疫卻不能保護(hù)豬抵抗PRV強(qiáng)毒株的攻擊。用gC核酸疫苗肌肉或皮下免疫3次，在血清中能檢測(cè)到抗gC的抗體，并可使豬對(duì)NIA-3產(chǎn)生部分保護(hù)，還能產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。Montail等(1996)構(gòu)建了含PRV gD基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。以其接種新生仔豬，結(jié)果顯示，未曾加強(qiáng)免疫過(guò)的仔豬和經(jīng)過(guò)加強(qiáng)免疫的仔豬，都能夠產(chǎn)生中等水平的中和抗體，但對(duì)PRV的攻擊不具保護(hù)力。編碼gB的DNA疫苗可誘導(dǎo)豬的細(xì)胞免疫并減少排毒。

1.核酸疫苗的優(yōu)點(diǎn)。能克服偽狂犬病病毒的潛伏感染，安全性高，免疫期長(zhǎng)，而且能激發(fā)細(xì)胞免疫。

2.核酸疫苗的缺點(diǎn)。雖然核酸疫苗的免疫能產(chǎn)生較高的抗體水平，但對(duì)強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)力不理想，因此，核酸疫苗的廣泛應(yīng)用還有一段漫長(zhǎng)的路要走。

(四)重組疫苗

1.以腺病毒為載體的重組疫苗。ELA基因編碼腺病毒的主要轉(zhuǎn)錄激活因子，因此ELA－腺病毒在不表達(dá)ELA的細(xì)飽中，不能復(fù)制。Hammond JM等以這種復(fù)制缺陷型腺病毒為載體構(gòu)建了1株表達(dá)PRVgD的ELV-重組腺病毒PRV-gD。用該重組病毒通過(guò)多種途徑分別接種兔和小鼠，均能產(chǎn)生對(duì)gD的免疫應(yīng)答。一些免疫接種的動(dòng)物可以抵抗致死量PRV的攻擊；豬接種重組病毒能產(chǎn)生高水平的抗gD抗體，并能有效抵抗強(qiáng)毒的攻擊。

2.以豬痘病毒為載體的重組疫苗。豬痘病毒甚因組容量大，可以插入較大的或多個(gè)外源片段。由于豬是其唯一宿主，因此，豬痘病毒作為載體，除了具有痘病毒載體的優(yōu)越性外，還具有豬宿主特異性的特點(diǎn)。Van dre Leek等，(1999)將PRV gD和gI基因插入豬痘病毒中，用獲得的重組病毒接種豬，能使豬獲得對(duì)PRV強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)。

3.豬偽狂犬病毒載體。豬的重組疫苗大多是以豬偽狂犬病毒為載體。PRV是雙鏈DNA病毒，基因組長(zhǎng)達(dá)150Kb，其中存在許多病毒復(fù)制非必需的基因，允許插入外源基因，這表明PRV本身就是潛在的病毒載體。最近PRV己被構(gòu)建成表達(dá)外源基因的強(qiáng)有效的表達(dá)載體。盡管這些載體還沒(méi)有一種獲得實(shí)際應(yīng)用，但是(缺失gE)被標(biāo)記的PRV與經(jīng)典豬瘟的重組病毒確實(shí)有助于用一種疫苗免疫來(lái)同時(shí)預(yù)防這兩種豬的毀滅性疾病。已確定了許多不同的位點(diǎn)可以用于插入幾種不同的外源基因。

Van Ziji等成功地構(gòu)建了表達(dá)HCV E1基因的重組PRV疫苗株。重組病毒免疫后，保護(hù)豬不僅能抵抗PRV攻毒，而且能抵抗HCV致死性的攻毒。因此，用一種病毒疫苗能夠預(yù)防豬的2種重要的病毒性疾病。Peeters等把CSFV E2基因整合于PRV gE基因缺失突變株的gD位點(diǎn)，構(gòu)建了表達(dá)E2的gE、gD雙基因缺失重組病毒。這種重組病毒作為雙價(jià)疫苗，能使豬同時(shí)獲得對(duì)PRV和CSFV兩種強(qiáng)毒致死攻擊的保護(hù)。由于gD基因的缺失，從而阻止了感染性PRV的產(chǎn)生，從而解決了重組病毒的生物安全問(wèn)題。但比較而言，這種重組病毒的保護(hù)效果較差。

4.重組疫苗的優(yōu)點(diǎn)。載體病毒較穩(wěn)定，免疫原性持久，刪除毒力基因的活載體疫苗能誘發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫，避免了滅活苗免疫的缺點(diǎn)，接種方便安全。

5.重組疫苗的缺點(diǎn)。有些載體對(duì)人或動(dòng)物具有潛在致病性，對(duì)人或動(dòng)物具有潛在的威脅。另外，重復(fù)使用會(huì)使動(dòng)物對(duì)載體病毒產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

四、結(jié)語(yǔ)

豬偽狂犬病極大地危害著世界各國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)，獸醫(yī)工作者已在豬偽狂犬疫苗的各個(gè)方面做了大量工作，也取得了令人欣喜的成果，在PR的防制工作中起到了不可估量的作用。在豬偽狂犬的眾多疫苗中，基因缺失疫苗免疫能與自然感染相區(qū)分，一些國(guó)家已推廣使用基因缺失疫苗(多為gE-表型)免疫豬群，配以相應(yīng)的鑒別診斷方法來(lái)實(shí)施豬偽狂犬凈化計(jì)劃，并取得較理想的成果。此外，由于PRV毒力受多基因控制，病毒毒力的致弱往往伴有疫苗免疫保護(hù)效果的降低。因此，在進(jìn)一步揭示PRV基因組結(jié)構(gòu)和功能、基因表達(dá)調(diào)控及其誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答機(jī)理的基礎(chǔ)上構(gòu)建新的缺失突變株疫苗和發(fā)展雙價(jià)或多價(jià)載體疫苗將是今后豬偽狂犬疫苗發(fā)展的主要方向。隨著分子生物學(xué)研究的不斷發(fā)展和基因工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用，豬偽狂犬疫苗的研究可望在不久的將來(lái)會(huì)有更新的突破。

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