轉天蠶素AD(CAD)基因于紫花苜蓿的研究

劉秀明，朱海林，杜淑環(huán)，萬 秋，李海燕，李校堃

(1吉林農業(yè)大學生物反應器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，吉林長春130118;2溫州醫(yī)學院，浙江溫州325035;3吉林農業(yè)大學生命科學學院，吉林長春130118)

抗生素的發(fā)現和應用挽救了許多被致病菌感染的人，然而，隨著傳統抗生素的廣泛使用導致臨床耐藥株日益增多，從而使許多抗生素逐漸失去臨床應用的價值.因此，尋找新一代的抗菌藥已成為現時一項迫切的任務.抗菌肽(Antibacterial peptide，ABP)是廣泛存在于生物體內具有抵抗外界微生物侵害的一類小分子多肽，是生物天然免疫防御系統的重要組成部分.與傳統抗生素相比，抗菌肽具有相對分子量小、水溶性好、熱穩(wěn)定、廣譜抗菌、不易產生耐藥性、對真核細胞毒性作用低、有一定抑制某些惡性腫瘤作用等特點，顯示出了良好的臨床應用前景［1］.天蠶素AD(Cecropin AD，CAD)基因是人工合成的由Cecropin A的N端1～11肽段和Cecropin D的C端12～37肽段組成的雜合肽.據測定，化學合成的抗菌肽AD，其殺菌活性和抗菌譜都明顯高于天然抗菌肽(殺菌活性是Cecropin D的5～55倍，對枯草桿菌Bacillus subtilis的活性是 Cecropin A 的6倍)［2-3］.植物作為生物反應器生產藥用蛋白有如下優(yōu)點:1)植物細胞具有全能性;2)真核表達系統能正確表達和加工［4］;3)生產成本低;4)存儲、使用簡單方便［5］;5)使用安全.紫花苜蓿Medicago sativa是世界上最重要的飼料作物之一，具有抗逆性強，適應范圍廣，利用年限長，再生性強的特點.另外，紫花苜蓿具有廣泛的生態(tài)適應性和穩(wěn)定的生產力，每年可以收獲多次，而且由于本身能固氮，需肥量少，和其他植物相比投入少、生物量大，所以適宜作生物反應器.本研究利用根癌農桿菌LBA4404將CAD基因導入紫花苜蓿，成功得到了表達，并且表達的蛋白具有一定的抑菌活性.對利用紫花苜蓿作為植物反應器生產抗菌肽的研究有一定的意義.

1 材料與方法

1.1 菌種及質粒

根瘤農桿菌 Agrobacterium tumefaciens菌種LBA4404(含Ti輔助質粒)、大腸埃希菌 Escherichia coil菌株DH5α、質粒pCAMBIA1390R等由生物反應器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心提供.

1.2 酶及化學試劑

內切酶、DNA相對分子質量標準 DL2000、TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、PCR回收試劑盒、膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒購自TaKaRa公司;植物DNA抽提試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司、RNA抽提試劑盒購自捷瑞生物有限公司、通用型RT-PCR試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;地高辛標記試劑盒購自ROCHE(Cat.No.11 745 832 910).

1.3 CAD基因的合成

根據GenBank上登錄的Cecropin A和Cecropin D序列設計CAD堿基序列，按照植物偏好密碼子將CAD堿基序列重新改造，根據密碼子的簡并性消除在試驗中用到的酶切位點，并且引入對外源基因表達有促進作用的調控元件:Ω序列、Kozak序列及KDEL四肽序列.應用Primer Premier 5.0軟件，設計合成正向引物:ADP1、ADP2、ADP3，反向引物:ADP4、ADP5、ADP6(表 1)，并在基因兩端引入 KpnⅠ和BglⅡ酶切位點及保護堿基.采用基因重疊延伸拼 接 方 法［6］(Gene splicing by overlap extension，SOE)合成全長CAD基因(圖1).

表1 設計并合成的引物序列Tab.1 Primer sequences of designing

1.4 CAD基因中間克隆載體的構建及測序

合成的CAD基因片段通過8 g/L瓊脂糖凝膠電泳在紫外燈下檢測目的產物，并用凝膠回收試劑盒純化回收.將回收產物分別用限制性內切酶KpnⅠ和BglⅡ酶切，用PCR純化回收試劑盒回收目的片段.將目的基因片段與經相同酶切回收的pUC19大片段連接命名為pUC19CAD.反應產物轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，選擇陽性克隆菌進行菌落PCR鑒定，將鑒定正確的單菌落搖菌后保存菌種并測序，測序工作由上海生工生物工程服務有限公司完成.

1.5 植物雙元表達載體pCAMBIA1390RCAD構建

將測序正確的pUC19CAD和pCAMBIA1390R分別用限制性內切酶KpnⅠ和BglⅡ進行酶切，回收小片段CAD和大片段pCAMBIA1390R，連接并轉化大腸埃希菌感受態(tài)DH5α，通過菌落PCR篩選陽性克隆菌，搖菌并保種，命名為pCAMBIA1390RCAD(圖2).提取質粒進行酶切鑒定，將鑒定正確的植物雙元表達載體pCAMBIA1390RCAD用凍融法轉入農桿菌LBA4404制備工程菌.用PCR法對轉化菌落進行鑒定，經鑒定所得陽性單菌落為含目的基因的工程菌株.

圖1 PCR方法合成CAD基因全長策略圖Fig.1 Strategy to synthesize CAD gene by overlapping extension method of PCR

1.6 紫花苜蓿的轉化

將在種子培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L)上培養(yǎng)5～7 d的紫花苜蓿無菌苗子葉剪成0.3～0.5 cm小段;用含pCAMBIA1390RCAD農桿菌LBA4404(D600nm=0.5～0.6)浸染5～8 min，吸去外植體表面殘余菌液，置共培養(yǎng)基(TM-1+2，4-D 2 mg/L+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+ 瓊脂6 g/L+蔗糖30 g/L)上共培養(yǎng)3 d(25℃黑暗條件);轉入選擇培養(yǎng)基(TM-1+2，4-D 2 mg/L+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+Tim 300 mg/L+Hyg 20 mg/L+瓊脂6 g/L+蔗糖30 g/L)進行篩選，每2周繼代1次誘導胚性愈傷組織;待組織有綠色的芽點出現，將其轉移到分化培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+Tim 300 mg/L+Hyg 20 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖10 g/L)上繼續(xù)培養(yǎng)，每2周繼代1次，待芽長至3～5 cm高時，將其從外植體上分離開，轉移到生根培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+Hyg 20 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖10 g/L)中繼續(xù)伸長及生根.培養(yǎng)溫度25～26℃，每天光照16 h.3～4周后待根系發(fā)達后，打開瓶蓋，煉苗2～3 d，移栽到滅菌的土中繼續(xù)培養(yǎng).

圖2 植物表達載體pCAMBIA1390RCAD結構示意圖Fig.2 Structure of plant expression plasmid pCAMBIA1390RCAD

1.7 紫花苜?？剐灾仓甑腜CR檢測

取潮霉素抗性苗和未轉基因植株新鮮葉片各100 mg，置于液氮中研磨成細粉，按照植物基因組DNA提取試劑盒操作方法提取總DNA.取1μL總DNA為模板，用CAD基因上游引物ADP1和下游引物ADP6為引物，以非轉基因植株為陰性對照，以表達載體pCAMBIA1390RCAD為陽性對照，對基因進行PCR擴增檢測.反應體系為:2×Power Taq PCR MasterMix 10 μL，模板 DNA 1 μL，上下游引物各 1 μL(10 μmol/μL)，加 ddH2O 至 20 μL.擴增反應條件為:94℃預變性5 min;94℃變性45 s，64℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán);72℃后延伸3 min.通過8 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下分析擴增的DNA片段.

1.8 轉基因紫花苜蓿的 Southern blotting分析

取PCR檢測為陽性的紫花苜蓿植株葉片4 g，用CTAB法［7］提取苜?；蚪MDNA.每個苜蓿植株樣品取40～50 μg基因組DNA，用限制性內切酶KpnⅠ酶切過夜.將酶切好的基因組樣品用8 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳，使片段按照分子大小分開，用堿變性法處理凝膠后，再利用毛細轉移法將酶切后的DNA片段轉移到硝酸纖維素膜上.根據 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ試劑盒制備探針(TTTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAAC;TTACAACTCATCCTTGTTCTTAGCAAGAGCAGTAGCCTG)，42℃進行雜交過夜，顯色，分析雜交信號.

1.9 CAD轉基因植株體外抗菌活性鑒定

將沙門氏菌Salmonella及金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus單克隆培養(yǎng)過夜，搖至D600nm為0.4～0.6后，取100 μL均勻涂布于無抗生素的固體LB平板上，涂布均勻無液體后，在板上放入裁剪好的圓型濾紙，在其上加入20 μL蛋白樣品.待加入的液體被吸收之后，將平板正置于37℃培養(yǎng)箱中，過夜.

2 結果與分析

2.1 CAD基因的克隆及測定

利用PCR搭橋法合成CAD全長基因，得到長度為229 bp的基因片段(圖3A)，與預期一致.將目的基因片段與測序載體 pUC19連接并轉化 E.coli DH5α感受態(tài)細胞，選擇陽性克隆菌進行菌落PCR鑒定(圖3B)，PCR鑒定為陽性的菌落測序結果與預期一致.

2.2 植物雙元表達載體 pCAMBIA1390RCAD的構建

將CAD基因定向插入pCAMBIA1390R載體中，得到重組質粒pCAMBIA1390RCAD，經過限制性內切酶KpnⅠ和BglⅡ酶切得到了229 bp的目的片段和載體大片段(圖4).結果與預期一致，表明CAD基因已經整合進了重組質粒中.

圖3 CAD全長基因及其克隆菌的PCR鑒定Fig.3 PCR amplification of CAD gene and identification of colony

圖4 重組質粒pCAMBIA1390RCAD的酶切鑒定Fig.4 Restriction digestion analysis of recombinant plasmid pCAMBIA1390RCAD

2.3 農桿菌的轉化

利用凍融法將重組質粒pCAMBIA1390RCAD轉入農桿菌LBA4404，用菌落PCR法對陽性菌落進行PCR鑒定，PCR擴增得到大小為229bp左右的CAD基因(圖5)，說明挑取的農桿菌可以用于下一步紫花苜蓿的轉化.

2.4 紫花苜蓿陽性植株的PCR鑒定

挑選潮霉素抗性植株，提取基因組DNA，非轉基因植株作為陰性對照，重組質粒pCAMBIA1390RCAD為陽性對照，以ADP1和ADP6為上、下游引物進行PCR擴增，結果顯示有目的條帶出現(圖6)，表明CAD已整合進苜?；蚪M.

圖5 農桿菌陽性克隆Fig.5 Screen of positive transformants of Agrobacterium tumefaciens

圖6 轉基因苜蓿植株的PCR檢測Fig.6 Identification of transgenic plants by PCR amplification

2.5 轉基因植株的Southern blotting分析

對PCR檢測為陽性的轉基因植株進行Southern blotting分析(圖7).結果顯示有4株出現雜交信號，而非轉基因植株沒有出現雜交信號.由此可以說明，目的基因CAD已經成功地整合進苜?；蚪M中.

2.6 轉基因植株的體外抗菌活性鑒定

對從轉基因苜蓿葉片中提取的總蛋白的抑菌活性進行了分析，選取2種不同的指示菌，即沙門氏菌和金黃色葡萄球菌.結果顯示，轉基因苜蓿對測試菌有抑菌圈出現，而野生型苜蓿沒有抑菌圈(圖8).

圖7 轉基因苜蓿植株Southern blotting分析Fig.7 Identification of the transgenic plants by Southern hybridization

圖8 瓊脂糖擴散法測抑菌活性Fig.8 Results of agarose diffusion assay

3 討論

近年來，很多研究證實植物表達系統具有表達活性外源蛋白的能力，無論是在產品質量、成本和安全性等各方面都顯現出巨大優(yōu)勢［8］.但是，作為一種新型的表達系統，如何提高蛋白表達量，減少錯誤蛋白的修飾以及降低下游分離純化成本等問題是所有研究者共同面對的問題.

起始位點上游的調節(jié)序列，也對轉錄的效率有很大的影響，如Ω序列等.有研究顯示在煙草和水稻中，以CaMV35S為啟動子，插入Ω序列和內含子序列，使GUS基因的活性提高20～70倍［9］.所以本試驗在合成基因時在起始位點上游引入了Ω序列和Kozak序列.

為了提高外源蛋白的表達量，本試驗在抗菌肽的C端引入了KDEL序列.研究表明，蛋白質C端的KDEL序列能將蛋白質定位在內質網膜上，通過改變蛋白質的細胞定位和分泌途徑，能明顯地提高外源蛋白在宿主體內的表達水平［10-11］.

本研究利用植物生物反應器表達系統表達CAD基因，經PCR檢測、Southern blot檢測和抑菌活性檢測，結果表明:根癌農桿菌能夠成功介導CAD基因，整合到陽性紫花苜蓿轉化株的基因組中，抑菌活性結果表明，轉基因苜蓿具有一定的抑菌活性.本試驗將CAD基因導入紫花苜蓿中，可為今后利用生物反應器表達系統在植物中生產藥用蛋白的工程化提供參考.

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