黃芪注射液合川芎嗪注射液治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)理研究*

陳利鋒 吳 娟 何東初 吳江平

（廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院，湖北 武漢 430070）

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎乃正氣不足，風(fēng)寒濕三氣雜至而為之［1］，病機(jī)以經(jīng)脈閉阻、氣血不暢為主。滑膜細(xì)胞增殖異常和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）發(fā)病的關(guān)鍵，抑制滑膜細(xì)胞增殖和炎性細(xì)胞因子分泌對(duì)RA的防治有重要價(jià)值［2］。本研究采用與人類RA臨床特征接近的佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠模型，從疾病的發(fā)生發(fā)展、組織形態(tài)、細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）、白細(xì)胞介素（IL）-17、γ 干擾素（INF-γ）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)水平等方面進(jìn)行觀察，探討黃芪注射液與川芎嗪注射液協(xié)同作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 70只健康雄性Wistar大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量180～200 g，湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào)：SCXK （鄂）2008-0005，飼養(yǎng)于中國(guó)人民解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試藥與儀器 黃芪注射液 （規(guī)格10 mL/支，相當(dāng)于生藥20 g，黑龍江省珍寶島制藥有限公司，批號(hào)20101112），川芎嗪注射液（規(guī)格2 mL/支，鄭州卓峰制藥有限公司，批號(hào)0110112），甲氨蝶呤片（MTX）（規(guī)格2.5 mg/片，上海醫(yī)藥集團(tuán)有限公司信誼制藥總廠，批號(hào) 090528），雷公藤多苷片（TPT）（規(guī)格 10 mg/片，黃石飛云制藥有限公司，批號(hào)20100901）。完全弗氏佐劑（美國(guó)SIGMA 公 司 ）。 MIF、INF-17、VEGF、INF-γ 酶 聯(lián) 免 疫 試 劑 盒（R&D公司進(jìn)口分裝，20090312）。磷酸鹽緩沖液（武漢博士德生物工程有限公司）。Annexin V/FITC細(xì)胞凋亡試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，編號(hào) C1062），流式細(xì)胞儀（FACS Caliur，美國(guó)BD公司）。BMJ-1生物組織包埋機(jī)、QPJ-1C石蠟切片機(jī)（天津航空機(jī)電公司）；AXIOSKOP2PLUS光學(xué)顯微鏡。RaytoRT-6500酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems公司）。

1.3 造模及分組 將大鼠飼喂1周后，稱體質(zhì)量，除正常組10只外，剩余大鼠造模。選取大鼠的右足墊，在無(wú)菌條件下皮內(nèi)注射0.1 mL弗氏完全佐劑，正常對(duì)照組在同一部位，同樣方法注射0.1mL 0.9%氯化鈉注射液。造模后60只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、黃芪組、川芎組、配伍組、MTX組、雷公藤組，每組10只。

1.4 給藥方法 造模1周后開(kāi)始給藥，正常組、模型組給予0.9%氯化鈉注射液。黃芪組將黃芪注射液配制成3.6 g/mL的溶液。川芎組將鹽酸川芎嗪注射液配制成14.4 mg/mL的溶液。配伍組用0.9%氯化鈉注射液將黃芪注射液與川芎嗪注射液混合配制成每毫升含黃芪3.6 g、川芎嗪14.4 mg的溶液。MTX組將MTX研成細(xì)末，加0.9%氯化鈉注射液配置成1.8 mg/mL的混懸液。雷公藤組將雷公藤多苷片研制成末，配制成9 mg/mL的混懸液。各組均按10 mL/kg灌胃，每日1次。給藥3周后處死大鼠，期間觀察大鼠一般情況，稱量并記錄體質(zhì)量。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) （1）足趾腫脹程度的測(cè)量。造模前用足跖容積測(cè)量?jī)x測(cè)量各組右后足的足容積，造模后密切觀察足趾腫脹情況，并分別于造模后第7、14、21、28日測(cè)量右后足足容積，觀察治療藥物對(duì)大鼠足趾腫脹的影響。（2）細(xì)胞因子MIF、IL-17、INF-γ、VEGF的檢測(cè)。各大鼠斷頭取血4～5 mL于促凝管中，2000 r/min離心15 min，移取上清液并分裝，置于-60℃凍存?zhèn)溆茫徊捎妹嘎?lián)免疫吸附法，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按各細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示。采用t檢驗(yàn)及方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般狀況 見(jiàn)表1。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，正常組大鼠狀態(tài)良好，毛光色潤(rùn)，動(dòng)作靈敏，反應(yīng)迅速。模型組大鼠精神飲食、活動(dòng)能力、反應(yīng)情況均降低。造模前各組大鼠體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模1周后各組大鼠體質(zhì)量與正常組比較，均明顯下降（P＜0.05）。給藥3周后，配伍組、MTX組及雷公藤組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)較模型組明顯（P＜0.05），配伍組體質(zhì)量與MTX、雷公藤組、正常組相當(dāng)（P＞0.05），優(yōu)于黃芪、川芎組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（g，±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（g，±s）

與正常組同時(shí)期比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組同時(shí)期比較，△P＜0.05；與配伍組同時(shí)期比較，▲P＜0.05。下同。

組 別 n 造模前 造模后1周 給藥后3周正常組 10 228.4±14.9 259.1±17.22 310.8±21.55模型組 10 226.5±13.3 230.6±15.44* 250.9±19.34黃芪組 10 227.4±15.6 231.5±13.36* 271.2±16.88▲川芎組 10 225.9±11.2 233.2±14.22* 269.6±17.57▲配伍組 10 226.3±12.7 232.3±12.55* 308.5±22.34△MTX 組 10 224.8±13.4 234.7±15.66* 305.1±11.44△雷公藤組 10 227.1±14.1 233.9±18.24* 306.9±20.65△

2.2 大鼠足趾腫脹度比較 見(jiàn)表2。造模前各組大鼠右后足趾腫脹度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模后肉眼觀察，模型大鼠右后足趾和踝關(guān)節(jié)紅腫明顯并逐日加重。造模后1周，各組大鼠右后足趾與正常組比較，腫脹度明顯增高（P＜0.05），說(shuō)明造模成功；造模后3周，給藥組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度與模型組比較明顯緩解，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），配伍組與雷公藤組效果相當(dāng)（P＞0.05），優(yōu)于黃芪、川芎組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠右后足趾腫脹度比較（mL，±s）

表2 各組大鼠右后足趾腫脹度比較（mL，±s）

組 別 n 造模前 造模后1周 給藥后3周正常組 10 1.05±0.04 1.07±0.02 1.10±0.05模型組 10 1.06±0.08 2.25±0.12* 2.23±0.14黃芪組 10 1.04±0.06 2.26±0.02* 1.87±0.16△▲川芎組 10 1.08±0.11 2.29±0.03* 1.91±0.11△▲配伍組 10 1.05±0.12 2.33±0.13* 1.63±0.21△MTX 組 10 1.07±0.08 2.30±0.11* 1.47±0.07△雷公藤組 10 1.06±0.05 2.28±0.15* 1.61±0.19△

2.3 各組細(xì)胞因子 MIF、IL-17、INF-γ、VEGF含量比較 見(jiàn)表3。 造模后 1 周各組大鼠血清 MIF、IL-17、INF-γ、VEGF 的含量與正常組比較明顯增高（P＜0.01），說(shuō)明造模成功，大鼠炎性反應(yīng)明確。各給藥組均可下調(diào)AA大鼠血清中MIF、IL-17、INF-γ、VEGF的含量 （P＜0.05），其中配伍組優(yōu)于黃芪、川芎組 （P＜0.05），IL-17與雷公藤組效果相當(dāng)。說(shuō)明配伍組能明顯降低促炎癥細(xì)胞因子的含量，以減輕AA大鼠炎癥反應(yīng)，使關(guān)節(jié)損傷逐漸減輕。

表3 各組血清 MIF、IL-17、INF-γ、VEGF 水平比較（±s）

表3 各組血清 MIF、IL-17、INF-γ、VEGF 水平比較（±s）

與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05；與配伍組比較，▲P＜0.05。

組 別 n IL-17（pg/mL） VEGF（ng/L）正常組 10 4.99±0.30△ 86.40±8.46△模型組 10 25.60±0.84** 401.04±20.86**黃芪組 10 19.73±1.14**△▲ 240.33±12.09**△▲川芎組 10 21.93±1.73**△▲ 252.37±15.72**△▲配伍組 10 15.13±0.98**△ 157.51±14.01**△MTX 組 10 9.00±1.76**△▲ 106.54±16.07**△▲雷公藤組 10 15.01±1.58**△ 184.17±8.01**△▲MIF（μg/L） INF-γ（ng/L）5.50±0.44△ 40.34±16.33△22.08±0.99** 283.53±16.76**15.89±0.91**△▲ 183.29±4.04**△▲16.01±1.09**△▲ 196.09±9.13**△▲12.26±0.76**△ 145.81±7.36**△9.25±0.60**△▲ 90.98±18.16**△▲14.57±0.61**△▲ 166.09±13.55**△▲

3 討 論

RA以周圍關(guān)節(jié)的對(duì)稱性炎癥為主要特征，屬中醫(yī)學(xué) “痹證”范疇，又有“頑痹”、“歷節(jié)風(fēng)”之稱［3］。 目前西醫(yī)治療主要使用非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑，這些藥物服藥時(shí)間長(zhǎng)，毒副作用大；而中醫(yī)藥治療RA具有一定優(yōu)勢(shì)，療效肯定，毒副作用小，具有控制炎癥和免疫調(diào)節(jié)等多方面的綜合作用［4］。

黃芪注射液中黃芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表、托毒生肌、利水消腫之功，有促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌及機(jī)體免疫的功能，同時(shí)又可抗病毒、減少炎癥滲出、提高膠原纖維的彈性［5］。川芎嗪是川芎的主要活血成分之一，其對(duì)多種細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)都有抑制作用。兩者合用，即可益氣扶正行血，又能活血舒筋經(jīng)絡(luò)，在臨床治療中取得了一定的療效。前期研究已證實(shí)，該配伍能降低AA大鼠滑膜細(xì)胞的凋亡率，降低血清細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α、IL-1、IL-6的水平［6］。本實(shí)驗(yàn)中加大藥物的劑量及質(zhì)量濃度，進(jìn)一步探討其對(duì)AA大鼠的影響及作用機(jī)制。

大鼠體質(zhì)量作為一個(gè)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，可以反映藥物的安全性及該藥對(duì)消化系統(tǒng)的影響，同時(shí)大鼠反應(yīng)度、活動(dòng)度等一般情況也可作為藥物整體療效的側(cè)面反映。MIF是一個(gè)具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，它在基因水平同RA存在相關(guān)性，通過(guò)促進(jìn)RA的炎癥反應(yīng)、滑膜組織增生和關(guān)節(jié)損傷3個(gè)方面參與RA的發(fā)病，是RA的一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)［7］。VEGF通過(guò)與其受體特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮的增生和新生血管的形成、參與炎癥反應(yīng)的形成和發(fā)展［8］。IL-17能上調(diào)血VEGF的水平，增加 VEGF mRNA的表達(dá)［9］。INF-γ增強(qiáng) NK細(xì)胞的活性，刺激并增強(qiáng)了炎癥反應(yīng)［10］。這些致炎性細(xì)胞因子在RA的發(fā)病及病情發(fā)展中相互作用，形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，直接或間接促進(jìn)血管的增生、血管翳的形成，可作為RA病情活動(dòng)的參考指標(biāo)。

結(jié)果表明，該配伍能改善AA大鼠的一般病變情況，包括體質(zhì)量、精神狀態(tài)、活動(dòng)能力以及關(guān)節(jié)的腫脹程度；顯著降低血清中促炎細(xì)胞因子MIF、IL-17、INF-γ及VEGF的含量。說(shuō)明黃芪聯(lián)合川芎嗪注射液可以通過(guò)抑制AA大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞的增生及炎性細(xì)胞因子的分泌，減輕AA大鼠關(guān)節(jié)的破壞作用，而且對(duì)AA大鼠的生長(zhǎng)無(wú)不良影響，體現(xiàn)了組方“扶正祛邪”的配伍原理，為證實(shí)該復(fù)方的抗炎作用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，同時(shí)具有一定的臨床實(shí)踐意義。

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