rt－PA在血腦屏障氧糖剝奪體外模型中對神經(jīng)細胞保護的研究1）

胡 俊，陳旭輝，吳 軍

重組組織型纖溶酶原激活劑（recombinant tissue－type plasminogen activator，rt－PA）是絲氨酸蛋白酶家族的一員，主要作用是激活纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶。rt－PA對血栓的選擇性高，半衰期短，無抗原性；是迄今為止唯一被美國FDA批準用于急性腦梗死的溶栓藥物，可溶解血栓，早期開通閉塞的血管，恢復血供，減少腦組織損傷。歐美國家相繼開始了rt－PA靜脈溶栓治療急性腦梗死的大規(guī)模、多中心、隨機對照實驗，美國的NINDS、歐洲ECASS等臨床實驗均證實溶栓治療有明顯療效［1，2］。但是由于rt－PA靜脈溶栓治療時間窗只有3h，極大地限制了其在臨床上的應用。近年有研究表明［3，4］，rt－PA除了參與溶栓過程之外，還可能參與血腦屏障（BBB）后期的血管生成、神經(jīng)生成和軸突再生。本實驗進一步探討rt－PA對血腦屏障氧糖剝奪后神經(jīng)細胞的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）、rt－PA、VEGF ELISA、小牛血清、胰蛋白酶、馬血清、考馬斯亮藍、甘氨酸、丙烯酰胺、MTT、相差倒置顯微鏡、振蕩器、酶聯(lián)免疫檢測儀、紫外可見分光光度計TU－1810D等。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC細胞培養(yǎng) HUVEC細胞株用含有10%FCS的RPMI－1640培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞貼壁生長，細胞呈菱形。當細胞接近70%～80%融合時以0.25%胰酶＋0.02%EDTA消化液消化后傳代。HUVEC細胞濃度取2×105／mL用于各項實驗。

1.2.2 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng) 海馬神經(jīng)元取自C57BL／6新生鼠，75%乙醇消毒 ，取出大腦置于冷的Hanks平衡鹽溶液中，迅速剝離分出兩側(cè)海馬組織，轉(zhuǎn)移至0.25%的胰酶中37℃消化15min。血清終止消化，1 500r／min，4℃離心10min以沉降組織。用冷的10%DMEM清洗組織一次，離心后重懸，吹打使組織成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為5×104／mL。接種于多聚鳥氨酸處理的培養(yǎng)瓶、24孔板與96孔板中。培養(yǎng)第2天將DMEM培養(yǎng)液換成神經(jīng)元培養(yǎng)液（配方如下），每周進行兩次換液。

1.2.3 血腦屏障的建立 利用24孔Transwell培養(yǎng)小室，在培養(yǎng)HUVEC之前，用0.5%明膠包被3μm孔徑的薄膜，用HUVEC細胞含有10%FCS的RPMI－1640培養(yǎng)液中加入含40%培養(yǎng)膠質(zhì)細胞后的培養(yǎng)液，混合在一起進行BBB的血管上皮細胞培養(yǎng)，使其產(chǎn)生和維護BBB的特性，培養(yǎng)24h后單個細胞形成單層細胞。

1.2.4 氧糖剝奪實驗（OGD） 將惰性混合氣體（5%CO2＋95%N2）供應裝置連接到轉(zhuǎn)移箱的閥門上，激活轉(zhuǎn)移箱泵的微調(diào)開關以抽真空，當手套伸進手套箱并稍微觸及箱體底部時，關閉真空泵，打開氣閥輸入混合氣體。將溫度設定在37℃，預熱半小時，待用。

1.2.5 rt－PA對神經(jīng)元活性的作用測定 調(diào)整神經(jīng)元細胞濃度為2×105／mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，加入rt－PA，使其濃度分別為40μg／mL、20μg／mL、1 0μg／mL、5μg／mL、2.5 μg／mL、1.25μg／mL、0.625μg／mL和0.312 5μg／mL分別加入到神經(jīng)元細胞中，100μL／孔，每個rt－PA藥物濃度設4個平行孔，同時設細胞對照，置厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)7h，另外一組以同樣方式每個rt－PA藥物濃度設4個平行孔，同時設細胞對照，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7h，用MTT法進行檢測，每孔加入MTT溶液（5mg／mL），每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度，記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料采用卡方檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度rt－PA對非OGD條件下培養(yǎng)的神經(jīng)細胞活性影響 在非 OGD條件下，高濃度rt－PA（40μg／mL、20μg／mL、10μg／mL、5μg／mL）對神經(jīng)細胞有毒性作用；而低濃度rt－PA（0.312 5μg／mL）對神經(jīng)細胞的生長有促進作用。詳見圖1。

圖1 不同濃度rt－PA對非OGD條件下培養(yǎng)的神經(jīng)細胞活性影響

2.2 不同濃度rt－PA對OGD條件下培養(yǎng)的神經(jīng)細胞活性影響 在OGD條件下，除高濃度rt－PA（40μg／mL、20μg／mL、10μg／mL、5μg／mL、）對神經(jīng)細胞有毒性作用外；低濃度rt－PA（0.625μg／mL，0.312 5μg／mL）對神經(jīng)細胞保護作用。詳見圖2。

圖2 不同濃度rt－PA對OGD條件下培養(yǎng)的神經(jīng)細胞活性影響

2.3 不同濃度rt－PA對厭氧與非厭氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)細胞活性影響比較 為更能說明rt－PA對神經(jīng)細胞的保護作用，在OGD和非OGD條件下，rt－PA對神經(jīng)細胞的保護作用進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1.25μg／mL，0.625μg／mL，0.312 5μg／

mL三個濃度均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見圖3。

圖3 不同濃度rt－PA對厭氧與非厭氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)細胞活性的影響

3 討 論

重組組織型纖溶酶原激活劑是由血管內(nèi)皮細胞合成并儲存及釋放的一種絲氨酸蛋白酶，主要的生物學功能是激活纖溶酶原轉(zhuǎn)變成纖溶酶，纖溶酶將纖維蛋白及血漿凝血因子（如因子Ⅴ／Ⅷ）降解，從而使血管再通。rt－PA也是被美國FDA批準用于治療急性缺血性腦梗死的藥物。對于rt－PA治療缺血性腦梗死的利弊，目前仍有諸多爭議，有的觀點認為rt－PA在溶解血栓之后，會進一步影響血腦屏障的功能，并且導致血腦屏障通透性的開發(fā)，例如通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP－9）、NMDA受體等，引發(fā)腦出血、腦水腫的發(fā)生。還有學者認為rt－PA具有神經(jīng)毒性作用：①rt－PA通過作用于NMDA型谷氨酸受體的NRⅠ型亞基，導致鈣離子內(nèi)流的增加，引起神經(jīng)細胞的破壞，并促進神經(jīng)元的凋亡［5，6］。②rt－PA 通過激活MMPs，特別是MMP－9的大量激活，MMP－9通過降解細胞外基質(zhì)（ECM）和血管基底膜，導致血腦屏障的破壞，引起腦水腫和腦出血［7］。③rt－PA誘導低密度脂蛋白受體相關性蛋白（low density lipoprotein receptor－related protein，LRP）的激活，引起血腦屏障的開放，通透性增加。另外，關于rt－PA劑量的選擇，也一直存在著矛盾，歐美建議急性腦梗死靜脈溶栓治療使用0.9mg／kg，而根據(jù)亞洲人群的體質(zhì)，也有觀點建議使用0.6mg／kg［8］。而本研究發(fā)現(xiàn)，在不同rt－PA 藥物的濃度作用下，通過采用MTT方法檢測在OGD和非OGD不同條件下神經(jīng)細胞的活性。結(jié)果表明，在非OGD條件下，高濃度rt－PA（40μg／mL、20μg／mL、10μg／mL、5μg／mL）對神經(jīng)細胞有毒性作用；而低濃度rt－PA（0.312 5μg／mL）對神經(jīng)細胞生長具有促進作用，與對照組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在OGD條件下，除高濃度rt－PA（4 0μg／mL、2 0μg／mL、1 0μg／mL、5 μg／mL）對神經(jīng)細胞有毒性作用外；低濃度rt－PA（0.625 μg／mL，0.312 5μg／mL）對神經(jīng)細胞有保護作用，與 OGD條件下的神經(jīng)細胞活性對照，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。但本實驗還發(fā)現(xiàn)在OGD以及非OGD條件下，同時進行rt－PA對神經(jīng)細胞活性作用的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1.25μg／mL、0.625μg／mL、0.312 5μg／mL三個濃度均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果證明，rt－PA在高濃度對神經(jīng)細胞具有毒性作用，而在低濃度時，無論在OGD或者非OGD條件，rt－PA都對神經(jīng)細胞有保護作用。但rt－PA在血腦屏障氧糖剝奪體外模型中對神經(jīng)細胞的保護機制，目前仍甚少研究，有研究認為［9］rt－PA通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶通徑，可修整細胞的凋亡程序，從而達到保護神經(jīng)細胞的作用，但進一步的研究仍需更多的努力。

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