脂聯(lián)素受體在正常SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞的分布和表達(dá)1）

王 敏，柴穎儒，肖傳實(shí)，衛(wèi) 娜，邊云飛

脂聯(lián)素（adiponectin，APN）是由脂肪組織分泌的一種激素，在體內(nèi)代謝平衡中發(fā)揮著重要的作用，多項(xiàng)研究顯示脂聯(lián)素有抗炎、抗動(dòng)脈硬化、抗胰島素抵抗的作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素參與了缺血／再灌注損傷的心肌保護(hù)［1］，而脂聯(lián)素的此種保護(hù)作用需要與其特異受體相結(jié)合而發(fā)揮作用，經(jīng)典的脂聯(lián)素受體（AdipoR）分為AdipoR1和AdipoR2，AdipoR1在骨骼肌中高度表達(dá)，AdipoR2在肝臟中高度表達(dá)［2］。近年發(fā)現(xiàn)T－鈣黏蛋白（T－cadherin）是脂聯(lián)素的又一新受體［3］，而在心肌細(xì)胞上，這三種脂聯(lián)素受體是否均表達(dá)且表達(dá)量如何，目前文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究采用體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，研究心肌細(xì)胞上脂聯(lián)素受體的表達(dá)情況，為脂聯(lián)素對(duì)心肌受損后的保護(hù)作用提供理論支持和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠乳鼠，1d～3d齡，雌雄不限，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、4%多聚甲醛、Triton X－100（Solarbio，Spain）；PCR引物（上海生物工程技術(shù)有限公司）；兔抗鼠α－肌動(dòng)蛋白一抗及FITC羊抗兔二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；兔抗大鼠AdipoR1一抗、兔抗大鼠AdipoR2一抗、兔抗大鼠T－cadherin一抗（Santa Cruz公司，美國(guó)）；即用型SABC試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。HERA cell 150細(xì)胞培養(yǎng)箱、Mini－Sub Cell GT、Bio－Rad水平電泳系列、Ge Doc、Bio－Rad凝膠成像系統(tǒng)、Nikon TS100倒置顯微鏡、OlympusIX50熒光倒置顯微鏡，由山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院干細(xì)胞研究中心提供。

1.3 方法

1.3.1 乳鼠心室肌細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 經(jīng)動(dòng)物管理委員會(huì)同意，選用出生1d～3d齡的SD乳鼠，據(jù) Webster等［4］方法并加以改進(jìn)，無(wú)菌條件下操作，沿左腋處剪開(kāi)胸廓取下心臟，采用Ⅱ型膠原酶進(jìn)行反復(fù)吹打消化，差速貼壁法培養(yǎng)并分離純化心室肌細(xì)胞，將細(xì)胞懸液以1×106／cm3的密度接種于培養(yǎng)板。約96h后，待貼壁心肌細(xì)胞伸出偽足，連成片狀，搏動(dòng)良好趨于同步化后進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 原代心室肌細(xì)胞的鑒定 采用免疫熒光法，針對(duì)胞漿中α肌動(dòng)蛋白，兔抗鼠α肌動(dòng)蛋白一抗及FITC－羊抗兔熒光二抗鑒定心肌細(xì)胞。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)選用原代培養(yǎng)的正常單層心室肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 RT－PCR測(cè)定 采用 Trizol（TaKaRa）提取總 RNA，微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA量，吸光度值（A260／280）均在1.8～2.0。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目的基因引物序列AdipoR1：上游5′－CTGCTGGTCCTTCACAGACA－3′，下游5′－CATCCGCCTTACAAAGT－3′，172bp。AdipoR2：上游5′－ACCCACAACCTTGCTTCATC－3′，下游5′－GCTAGCCATGAGCATTAGCC－3′，233bp。T－cadherin：上游5′－GGCAGAGCTTTGAGATCCAC－3′，下游5′－GACTGGTCCCTCGTTGACAT－3′，206bp。甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）：上游5′－TGAACGGGAAGCTCACTGG－3′，下游5′－TCCACCACCCTGTTGCTGTA －3 307bp。條件：92℃預(yù)變性2min，92℃變形30s，55℃退火30 s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。擴(kuò)增片段通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)掃描，利用Quantity one 4.6.2分析系統(tǒng)測(cè)定灰度值，目的基因PCR產(chǎn)物的相對(duì)表達(dá)含量＝目標(biāo)基因電泳條帶灰度值／GAPDH電泳條帶灰度值。

1.3.5 細(xì)胞免疫組織化學(xué)方法檢測(cè) AdipoR1、AdipoR2、T－cadherin蛋白表達(dá) 將心肌細(xì)胞培養(yǎng)于蓋玻片上，生長(zhǎng)約96h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用SABC法染色。具體步驟：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，PBS漂洗3次，95%乙醇固定5min。PBS漂洗2min×5次，3%H2O2滅活內(nèi)源性酶10min，蒸餾水沖洗，PBS漂洗，滴加一抗（1∶100），37℃孵育3h，PBS漂洗5min×5次。滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育20min，PBS漂洗5min×5次。滴加SABC復(fù)合物，37℃孵育30min，PBS漂洗2min×3次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水漂洗，在各級(jí)酒精中脫水，二甲苯透明，樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察、照相，以細(xì)胞漿著棕黃色為陽(yáng)性。每張片子隨機(jī)選取6個(gè)高倍鏡視野（×200），用Image proplus 6.0專(zhuān)業(yè)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量每個(gè)視野的光密度值，然后計(jì)算出平均吸光度值（A）來(lái)表示細(xì)胞上各種蛋白的表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1 乳鼠心室肌細(xì)胞鑒定 倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)原代心肌細(xì)胞成簇生長(zhǎng)，形態(tài)多樣，呈梭形、星形及圓形等，細(xì)胞伸出偽足，折光性強(qiáng)，且搏動(dòng)明顯，核居中呈卵圓形。免疫熒光法鑒定：熒光倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈扁平多角形，胞漿呈綠色熒光陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞達(dá)95%，非心室肌細(xì)胞胞漿無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，可用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 RT－PCR檢測(cè) RT－PCR的結(jié)果表明，AdipoR1、AdipoR2、T－cadherin的mRNA在SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞上均有表達(dá)，其中AdipoR1和T－cadherin的 mRNA表達(dá)量高，而AdipoR2的表達(dá)量較少，AdipoR1和T－cadherin的mRNA表達(dá)量與AdipoR2的表達(dá)量相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見(jiàn)圖1。

圖1 RT－PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞上AdipoR1、AdipoR2、T－cadherin的mRNA表達(dá)

2.3 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè) 分別在AdipoR1、AdipoR2和T－cadherin的免疫組化片子中，均可見(jiàn)心肌細(xì)胞胞漿中陽(yáng)性的棕黃色顆粒，AdipoR1和T－cadherin的A值分別為0.43±0.02、0.41±0.03，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但均高于AdipoR2的 A值（0.11±0.01，P＜0.01）。詳見(jiàn)圖2。

圖2 SABC法檢測(cè)心肌細(xì)胞AdipoR1、AdipoR2、T－cadherin蛋白表達(dá)（×200）

3 討 論

脂聯(lián)素是由脂肪組織分泌的一種激素，在血清中主要以三種形式存在：三聚體、六聚體和高分子質(zhì)量（HMW）多聚體［5］，其在體內(nèi)代謝平衡中發(fā)揮著重要的作用，多項(xiàng)研究顯示脂聯(lián)素有抗炎、抗動(dòng)脈硬化、抗胰島素抵抗的作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素參與了缺血／再灌注損傷的心肌保護(hù)［1］。使用脂聯(lián)素基因敲除鼠誘導(dǎo)缺血再灌注損傷，可見(jiàn)鼠的心肌梗死面積明顯擴(kuò)大，心肌細(xì)胞的凋亡和腫瘤壞死因子（TNF－α）的表達(dá)也明顯增加，腺病毒介導(dǎo)脂聯(lián)素的轉(zhuǎn)染減少了梗死的面積、心肌細(xì)胞的凋亡以及腫瘤壞死因子的表達(dá)［6］。大量的研究表明，脂聯(lián)素對(duì)缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，而脂聯(lián)素的此種保護(hù)作用需要與其特異受體相結(jié)合而發(fā)揮作用。

Yamauchi等［2］應(yīng)用分子克隆技術(shù)確定脂聯(lián)素受體存在兩種異構(gòu)體，分別為AdipoR1和AdipoR2，AdipoR1分布廣泛，在骨骼肌中含量豐富，AdipoR2則在肝臟中高度表達(dá)，AdipoR1、AdipoR2在結(jié)構(gòu)上高度相似，都包含7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和活化分子信號(hào)，與G蛋白耦聯(lián)受體家族的布局相反，序列上的同源性也很低，氨基端在細(xì)胞內(nèi)部，羧基端在細(xì)胞外部，AdipoR1、AdipoR2似乎不通過(guò)與G蛋白耦聯(lián)發(fā)揮作用，而是直接連接到下游過(guò)氧化物酶體增生物激活受體－α（PPAR－α）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、p38有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號(hào)分子，傳遞脂聯(lián)素的信息。近年，Hug等［3］通過(guò)分子克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn)T－cadherin是脂聯(lián)素的又一新受體，且是六聚體和高分子質(zhì)量多聚體的脂聯(lián)素受體，在心血管系統(tǒng)高度表達(dá)［7］。T－cadherin屬于鈣黏蛋白家族，由于T－cadherin缺失經(jīng)典cadherin分子所有的跨膜區(qū)而經(jīng)糖基磷脂酰肌醇（GPI）附著于細(xì)胞膜上［8］，所以T－cadherin或許是作為一種尚未被證實(shí)的復(fù)合物信號(hào)受體起作用，APN通過(guò)它傳遞代謝信號(hào)。

本研究結(jié)果顯示，在乳鼠心肌細(xì)胞上三種脂聯(lián)素受體的mRNA和蛋白均有表達(dá)，并以AdipoR1和T－cadherin表達(dá)為主，AdipoR2表達(dá)量較少，AdipoR1和T－cadherin與AdipoR2的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），推測(cè)脂聯(lián)素對(duì)損傷后心肌的保護(hù)作用，可能主要通過(guò)與AdipoR1和T－cadherin結(jié)合而發(fā)揮作用，AdipoR2在損傷后心肌的保護(hù)中所起作用較小。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素通過(guò)與AdipoR1結(jié)合活化AMPK進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)作用，并且AMPK信號(hào)通路對(duì)心肌具有保護(hù)作用，是心肌細(xì)胞肥大的重要調(diào)節(jié)機(jī)制［9］。另有學(xué)者研究認(rèn)為T(mén)－cadherin在APN介導(dǎo)的心肌保護(hù)作用中起著直接并至關(guān)重要的作用，分別在心肌肥大和缺血再灌注損傷模型中，T－cadherin基因敲除鼠心肌肥大加劇，心肌梗死面積增大，并且認(rèn)為APN對(duì)心臟的保護(hù)作用是通過(guò)結(jié)合T－cadherin主要激活A(yù)MPK信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)的［10］。本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)AdipoR2在心肌細(xì)胞上有少量表達(dá)，在以往研究中發(fā)現(xiàn)AdipoR2主要分布于肝臟，在心臟組織中未檢出其表達(dá)［2，11］。Ding等［12］研究在豬心臟中亦存在少量的AdipoR2的轉(zhuǎn)錄物，而由于AdipoR2在肝中高度表達(dá)，因此，推測(cè)脂聯(lián)素可能主要通過(guò)AdipoR2來(lái)調(diào)節(jié)肝糖的輸出和胰島素的敏感性，AdipoR2的主要功能為參與血糖與胰島素的調(diào)控。對(duì)于脂聯(lián)素在心肌受損后的保護(hù)作用中，三種脂聯(lián)素受體所起的作用還需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)研究證實(shí)。

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