氧化應(yīng)激在阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征與腦梗死中的作用分析

董曉瑩，李東芳

國(guó)外流行病學(xué)研究顯示，阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征 （OSAHS）患者腦血管病的發(fā)病率是40%～8 6%［1］，且OSAHS是高血壓病、冠心病、心肌梗死、肺心病及腦卒中等發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［2］。它具有起病隱匿、發(fā)病率高、潛在危險(xiǎn)大等特點(diǎn)，主要死因?yàn)樾哪X血管并發(fā)癥［3］，所以二級(jí)預(yù)防極為重要。但對(duì)于OSAHS導(dǎo)致腦梗死發(fā)生的作用機(jī)制仍不十分清楚。因此，進(jìn)一步明確OSAHS在腦梗死發(fā)病中的作用機(jī)制，為早期預(yù)防其導(dǎo)致腦梗死的發(fā)生及進(jìn)展是目前迫切需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。本課題通過(guò)病例對(duì)照研究探討氧化應(yīng)激在OSAHS引起動(dòng)脈粥樣硬化和腦梗死中的作用機(jī)制，為OSAHS患者合并腦梗死的臨床治療及預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年10月—2011年12月就診于我院的住院患者中選取腦梗死患者20例、OSAHS患者20例、腦梗死＋OSAHS患者20例作為病例組，在體檢中心選取同一時(shí)期的健康體檢者20名作為對(duì)照組。入組標(biāo)準(zhǔn)：腦梗死患者均符合1995年全國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并通過(guò)頸動(dòng)脈超聲、顱多普勒超聲（TCD）、頭顱核磁及磁共振血管造影（MRA）證實(shí)為大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死。OSAHS患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)睡眠呼吸疾病學(xué)組制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即臨床上有典型的夜間睡眠時(shí)打鼾及呼吸不規(guī)律，白天過(guò)度嗜睡，經(jīng)多導(dǎo)睡眠圖監(jiān)測(cè)提示每夜7h睡眠過(guò)程中呼吸暫停及低通氣反復(fù)發(fā)作在30次以上，或睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)（AHI）≥5次／h。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在下列情況之一者：合并冠心病、心房纖顫、心肌梗死、肝腎功能不全；合并慢性感染性疾病、自身免疫性疾病、應(yīng)用炎癥抑制藥物、免疫抑制劑以及小動(dòng)脈病變性腦梗死等其他類(lèi)型腦梗死。并收集臨床資料：年齡、性別、吸煙、飲酒、體重指數(shù)（BMI）、合并高血壓、2型糖尿病、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）。血清HDL＞5.7mmol／L為高膽固醇血癥，血清LDL＞3.12mmol／L為高低密度脂蛋白血癥。所有研究對(duì)象均為山西省太原市無(wú)血緣關(guān)系的漢族自然人，并均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度（IMT）的測(cè)定及判斷 檢測(cè)儀器：選用飛利浦IU22彩色多普勒超聲儀，探頭頻率為3MHz～9 MHz。檢測(cè)方法：患者取平臥頭仰位，雙肩墊枕，使頸部充分顯露，探頭置于頸部下頜角后方縱行向側(cè)后方向逐漸移動(dòng)，二維觀察血管走向、管腔內(nèi)徑、管壁厚度、有無(wú)斑塊等情況。測(cè)量指標(biāo)：頸動(dòng)脈IMT。判斷標(biāo)準(zhǔn)：IMT＜1.0mm為正常，1.0mm≤IMT＜1.2mm為內(nèi)膜增厚，IMT≥1.2mm為斑塊形成。病例組患者超聲檢查均在入院一周內(nèi)，對(duì)照組于體檢當(dāng)日由本院超聲室固定醫(yī)師檢測(cè)完成。

1.2.2 睡眠多導(dǎo)圖監(jiān)測(cè) 監(jiān)測(cè)儀器：為美國(guó)Tyco公司生產(chǎn)的Sandman Elite型64導(dǎo)睡眠診療系統(tǒng)及澳大利亞生產(chǎn)的Compumedics E－型44導(dǎo)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)。監(jiān)測(cè)指標(biāo)：AHI、夜間最低血氧飽和度、平均血氧飽和度、氧飽和度＜90%的時(shí)間所占的百分比。病例組患者均于入院一周內(nèi)，對(duì)照組于體檢一周內(nèi)在我院睡眠監(jiān)測(cè)中心行多導(dǎo)睡眠圖監(jiān)測(cè)。

1.2.3 標(biāo)本采集 所有受試者在知情情況下，自愿參與試驗(yàn)。在睡眠監(jiān)測(cè)檢查的第2天清晨空腹抽取肘靜脈血2mL，室溫凝固30min后離心（1 000r／min×15min），取上清液分裝后置于－70℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。本?shí)驗(yàn)所有試劑均由上海西唐生物科技有限公司提供；所用儀器有SPX－250B－D型振蕩培養(yǎng)箱、SPR－980自動(dòng)酶標(biāo)分析儀。

1.2.4 血清15－F2t－異前列烷的測(cè)定

1.2.4.1 準(zhǔn)備試劑 標(biāo)準(zhǔn)品液配制：使用前加入1mL蒸餾水混勻，配成20ng／mL的溶液。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管8管，第1管加標(biāo)本稀釋液900μL，第2管至第8管加入標(biāo)本稀釋液500μL。在第1管中加入20ng／mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液100μL混勻后用加樣器吸出500μL，移至第2管。如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋?zhuān)瑥牡?管中吸出500μL棄去。第8管為空白對(duì)照。10×標(biāo)本稀釋液用蒸餾水作1∶10倍稀釋。洗滌液用重蒸餾水1∶20稀釋。

1.2.4.2 檢測(cè)程序 加樣：每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120min；洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4次～6次，向?yàn)V紙上印干；每孔中加入第一抗體工作液100μL。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60min；洗板：同前；每孔加酶標(biāo)抗體工作液100μL，將反應(yīng)板置37℃30min；洗板：同前；每孔加入底物工作液100μL，置37℃暗處反應(yīng)15 min；每孔加入100μL終止液混勻；30min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光值。

1.2.4.3 結(jié)果計(jì)算與判定 所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品2 000pg／mL、1 000pg／mL、500pg／mL、250 pg／mL、125pg／mL、62.5pg／mL、31.2pg／mL、0pg／mL為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)樣品OD值在該曲線(xiàn)圖上查出相應(yīng)15－F2t－異前列烷含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；定性資料用頻數(shù)表示。4組中定量資料的比較采用單因素方差分析，定性資料的比較采用卡方檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD法分析，15－F2t－異前列烷和IMT之間的相關(guān)性在各組中以散點(diǎn)圖形式描述。

2 結(jié) 果

2.1 病例組與對(duì)照組一般資料比較 4組TC、LDL水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝3.510、2.822，P＜0.05）；年齡、性別、吸煙、飲酒、BMI、合并高血壓、2型糖尿病、TG、HDL在各組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 病例組與對(duì)照組一般資料比較

2.2 15－F2t－異前列烷和IMT檢測(cè)結(jié)果 4組的15－F2t－異前列烷和IMT差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因研究對(duì)象各組中TC和LDL亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用協(xié)方差分析扣除TC、LDL因素的影響后再次分析所研究變量。對(duì)15－F2t－異前列烷進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示F＝153.142，P＜0.001，說(shuō)明在扣除TC、LDL因素的影響后，4組的總體15－F2t－異前列烷均數(shù)有差別， 組 間比較除腦梗死組和OSAHS組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P＝0.384），其余各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)IMT進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示F＝183.056，P＜0.001，說(shuō)明在扣除TC、LDL因素的影響后，4組的總體IMT均數(shù)有差別，組間比較除腦梗死組和OSAHS組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P＝0.466），其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩變量的總體均數(shù)在腦梗死＋OSAHS組中均最大，在對(duì)照組中均最小，腦梗死組和OSAHS組居中。詳見(jiàn)表2。

表2 各組15－F2t－異前列烷和IMT檢測(cè)結(jié)果（x±s）

2.3 15－F2t－異前列烷和IMT的相關(guān)性 在各組中分別以15－F2t－異前列烷為橫坐標(biāo)，以IMT為縱坐標(biāo)，用散點(diǎn)圖描述兩者的相關(guān)性?？梢?jiàn)在病例組中兩者存在線(xiàn)性關(guān)系，而在對(duì)照組中無(wú)相關(guān)性，在病例組中的相關(guān)性以腦梗死＋OSAHS組中最明顯，呈直線(xiàn)相關(guān)。對(duì)照組：r＝－0.046，P＝0.847；腦梗死組：r＝0.460，P＝0.041；OSAHS組：r＝0.482，P＝0.032；腦梗死＋OSAHS組：r＝0.685，P＜0.001。

3 討 論

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征是腦梗死明確的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，動(dòng)脈粥樣硬化是OSAHS發(fā)生心腦血管病的始發(fā)因素和基本病因，氧化應(yīng)激在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。OSAHS患者典型的慢性間歇低氧所導(dǎo)致的低氧血癥和高碳酸血癥極易促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。而關(guān)于OSAHS導(dǎo)致腦梗死的機(jī)制方面研究仍不十分明確。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用協(xié)方差分析扣除TC和LDL的影響，通過(guò)檢測(cè)對(duì)照組、腦梗死組、OSAHS組、腦梗死＋OSAHS組15－F2t－異前列烷和IMT的差別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15－F2t－異前列烷和IMT在4組中差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。在各組中以散點(diǎn)圖描述15－F2t－異前列烷與IMT的關(guān)系，可知兩者在病例組中呈正相關(guān)，在腦梗死＋OSAHS組中直線(xiàn)相關(guān)較為明顯。這與Denis等［4］在2010年關(guān)于15－F2t－異前列烷和IMT關(guān)系的研究相類(lèi)似。氧化應(yīng)激導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的可能機(jī)制如下：氧化應(yīng)激可引起血漿中C反應(yīng)蛋白（CRP）、瘦素、白介素（IL）－1β、IL－6、IL－8、腫瘤壞死因子（TNF－α）及黏附分子等炎癥因子水平明顯升高，產(chǎn)生系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，為動(dòng)脈粥樣硬化的形成提供了充分的條件［5，6］。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧（ROS）損傷內(nèi)皮細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的啟動(dòng)步驟［7］。氧化應(yīng)激形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物的增加可導(dǎo)致血漿黏度增高、血小板聚集和血栓形成，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生［8，9］。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，LDL氧化修飾為氧化型低密度脂蛋白（ox－LDL），并通過(guò)多種途徑啟動(dòng)和促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，最終導(dǎo)致粥樣斑塊破裂，引發(fā)惡性心腦血管事件。

在OSAHS患者導(dǎo)致腦梗死發(fā)病的過(guò)程中，氧化應(yīng)激水平增高導(dǎo)致頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，頸動(dòng)脈硬化程度增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致腦梗死發(fā)病率上升可能是其重要的作用機(jī)制之一，故在臨床診療中應(yīng)積極對(duì)OSAHS患者進(jìn)行二級(jí)預(yù)防，延緩其進(jìn)展至腦梗死。

［1］ 中華神經(jīng)科學(xué)會(huì).各類(lèi)腦血管疾病診斷要點(diǎn)［J］.中華神經(jīng)科雜志，1996，29（6）：379－380.

［2］ McNicholas WT，Bonsigore MR.Sleep apnoea as an independent risk factor for cardiovascular disease：Current evidence，basic mechanisms and research priorities［J］.Eur Respir J，2007，29（1）：156－178.

［3］ Johnston SC，Rothwell PM，Nguygen－Hugnh MN，etal.Validation and refinement of scores to predict very early stroke risk after transient ischemic attack［J］.Lancet，2007，369（9558）：283－292.

［4］ Denis M，Jean－Louis P，Diane GR，etal.Association of urinary 15－F2t－isoprostane level with oxygen desaturation and carot－id intima– media thickness in nonobese sleep apnea patients［J］.Free Radical Biology ＆ Medicine，2010，48：619－625.

［5］ Dyugovskaya L，Lavie L.Increased adhesion of sleep apnea patients［J］.Am J Respir Crit Care Med，2002，165：934－939.

［6］ Jelic S，Padeletti M，Kawut SM，etal.Inflammation，oxidative stress，and repair capacity of the vascular endothelium in obstructive sleep apnea［J］.Circulation，2008，117：2270－2278.

［7］ Kokturk O，Ciftci TU，Mollarecep E，etal.Elevated C－reactive protein levels and increased cardiovascular risk in patients with obstructive sleep apnea syndrome［J］.Int Heart，2005，46：801－809.

［8］ Suzuki YJ，Jain V，Park AM，etal.Oxidative stress and oxidant signaling in obstructive sleep apnea and associated cardiovascular diseases［J］.Free Radic Biol Med，2006，40：1683－1692.

［9］ Lloret A，Buj J，Badia MC，etal.Obstructive sleep apnea：Arterial oxygen desaturation coincides with increases in systemic oxidative stress markers measured with continuous monitoring［J］.Free Radic Biol Med，2007，42：893－894.