碳酸氫鹽對馬鈴薯黑痣病菌毒力及田間防效

劉寶玉， 胡 俊， 蒙美蓮， 石立航， 何曉明， 燕瑞斌， 周建強

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，呼和浩特 010019）

馬鈴薯黑痣病的病原菌無性階段為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），有性階段為瓜亡革菌（Thanatephorus cucumeris），最早發(fā)現(xiàn)于馬鈴薯塊莖上［1]?，F(xiàn)在已經(jīng)證明，立枯絲核菌能夠?qū)е露喾N植物病害，并且對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴重的影響［2]。目前立枯絲核菌劃分為13個菌絲融合群［3]，馬鈴薯黑痣病菌屬于融合群 AG－3［4－6]。播種馬鈴薯薯塊后該病原菌侵染芽形成壞死，導(dǎo)致出苗晚或缺苗斷壟；苗期時侵害地下莖，形成紫褐色潰瘍斑，導(dǎo)致植株生長勢減弱或植株死亡；開花期以后地下莖病斑繼續(xù)擴大，最終導(dǎo)致植株枯萎死亡；匍匐莖受病原菌侵染，導(dǎo)致植株營養(yǎng)物質(zhì)不能良好地向薯塊運輸；薯塊受害導(dǎo)致畸形并且在其表皮形成黑點即黑痣，是翌年重要的初侵染來源。病菌能對馬鈴薯各生長期侵染危害，造成產(chǎn)量嚴重下降［7－8]。目前，對該病害的防治除輪作和農(nóng)藥防治外，還沒有其他更好的方法，而輪作防病需要較長的年限，由于土地有限很難達到要求。長期使用農(nóng)藥防病雖然取得了明顯的效果，但會對環(huán)境和人類的健康造成嚴重的危害［9－10]。

作者在對馬鈴薯黑痣病菌生物學(xué)特性的研究中發(fā)現(xiàn)，碳酸氫銨對立枯絲核菌有很好的抑制作用。據(jù)報道，碳酸鹽和碳酸氫鹽具有抑制多種病原真菌生長的作用［10，11－15]，早在1928年碳酸鹽就已經(jīng)用于柑橘采后病害的防治［16]。碳酸鹽和碳酸氫鹽還是最常見的食品添加劑，在歐洲和北美沒有任何的法規(guī)限制其使用［17]，說明該類鹽對環(huán)境和人類是安全的，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，碳酸鹽或碳酸氫鹽廣泛使用會使化學(xué)農(nóng)藥的使用明顯減少［18－19]。碳酸鹽和碳酸氫鹽除了能控制一些果蔬采后病害［14、20－22]外，還能提高羅倫隱球酵母菌（Cryptococcus laurentii）、叢生絲孢酵母菌（Trichosporon pullulans）等生防菌對梨采后病害的防效［23]。碳酸氫鉀能夠抑制核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）的菌絲生長、菌核形成及菌核萌發(fā)，在50 mmol／L濃度下，生防木霉菌（Trichoderma spp.）既能生長也能發(fā)揮其對核盤菌的拮抗作用［24]。

在中國的一些作物種植區(qū)，碳酸氫銨是一種普遍被使用的肥料，廉價、速效，以基肥施用。雖然碳酸氫銨是一種肥料，但在研究中發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抑菌作用，為此，作者研究了碳酸氫銨與碳酸氫鉀對馬鈴薯黑痣病田間防治效果，評價碳酸氫銨與碳酸氫鉀混配在生產(chǎn)中應(yīng)用價值，以明確其在生產(chǎn)中使用的方法、用量，為生產(chǎn)中綠色防控該病害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理教研室從感染黑痣病的馬鈴薯塊莖上分離，經(jīng)純化、致病性測定和鑒定，確定為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）。

1.2 供試培養(yǎng)基

PSA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂16g、水1 000mL；麥麩培養(yǎng)基：麥麩1 000g、水適量（約800mL）。

1.3 供試藥品

碳酸氫銨、碳酸氫鉀、硫酸鉀為分析純，由國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；專用肥（含氮量15%）由鎮(zhèn)賚吉人生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；尿素由寧海石油田野化工股份有限公司生產(chǎn)；過磷酸鈣由湖北放馬山磷化有限公司生產(chǎn)；25%嘧菌酯懸浮劑由瑞士先正達有限公司生產(chǎn)。

1.4 供試種薯

馬鈴薯品種為‘紫花白’原種，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院馬鈴薯研究室提供。

1.5 碳酸氫銨與碳酸氫鉀抑菌作用

采用菌落生長速率法。分別配制含有不同鹽類物質(zhì)（碳酸氫銨0.2、0.5、0.8、1.4、1.55、1.7g／L；碳酸氫鉀1、2、3、4、5、6g／L）的PSA培養(yǎng)基，以不加鹽類物質(zhì)的PSA培養(yǎng)基為對照，于121℃、30min滅菌，制備平板（d＝90mm），用直徑0.7cm無菌打孔器在25℃條件下培養(yǎng)48h的菌落邊緣打取菌餅，放于平板中央，每皿接1個菌餅，于25℃恒溫培養(yǎng)，待對照菌落長滿皿時，用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，每處理5次重復(fù)，并運用SAS軟件求出毒力回歸方程，算出EC50值（抑菌中濃度）。試驗重復(fù)4次。

分別配制含有不同鹽類物質(zhì)（碳酸氫銨1.58、0.79g／L；碳酸氫鉀2、1g／L；碳酸氫銨0.79g／L＋碳酸氫鉀1g／L）的PSA培養(yǎng)基，不加鹽類物質(zhì)的PSA培養(yǎng)基為對照，于121℃、30min滅菌后制備平板，接菌方法同上，于25℃恒溫培養(yǎng)，待對照長滿皿時，用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，每處理5次重復(fù)，并運用SAS軟件求出毒力回歸方程，算出EC50值（抑菌中濃度）。試驗重復(fù)4次。

1.6 盆栽試驗

2009年進行盆栽試驗，以基肥和追肥兩種方式進行施肥，每盆裝25kg無菌土。試驗處理Ⅰ：每1kg無菌土中基肥和追肥（分兩次進行追肥）分別以0.26g碳酸氫銨的量施入；處理Ⅱ：每1kg無菌土中基肥和追肥（分兩次進行追肥）分別以0.10g尿素的量施入；以不施肥為對照。將馬鈴薯黑痣病菌（在麥麩培養(yǎng)基中25℃恒溫培養(yǎng)30d）接入無菌土中，接菌量為0.24g／kg土。將馬鈴薯種薯表面消毒，種到不同處理的接菌土中，每盆3株，每處理9次重復(fù)，于苗期和收獲期分別調(diào)查地下莖、塊莖發(fā)病率，調(diào)查病級，計算病情指數(shù)以及防效，對每株塊莖進行稱量。運用SAS軟件進行統(tǒng)計分析。

馬鈴薯黑痣病地下莖病情分級標準［25]：0級，芽或地下莖沒有潰瘍斑，植株生長正常；1級，病斑面積占地下莖總面積的0%～5%；2級，病斑面積占地下莖總面積的6%～35%；3級，病斑面積占地下莖總面積的36%～65%；4級，病斑面積占地下莖總面積的66%～95%；5級，病斑面積占地下莖總面積的96%以上或植株枯萎死亡。

馬鈴薯黑痣病塊莖病情分級標準［25]：0級，薯塊表面沒有菌核；1級，菌核面積占整個薯塊面積的0%～5%；2級，菌核面積占整個薯塊面積的6%～35%；3級，菌核面積占整個薯塊面積的36%～65%；4級，菌核面積占整個薯塊面積的66%～95%；5級，菌核面積占整個薯塊面積的96%以上。

（對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）／對照病情指數(shù)×100。

1.7 田間接菌防治試驗

試驗于2009年和2010年在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場進行。每小區(qū)面積為4m2（小區(qū)之間用埋入土中的地膜隔開），種植16株馬鈴薯，寬窄行種植（寬行行距70cm，窄行行距40cm），小區(qū)隨機排列。將馬鈴薯黑痣病菌（以麥麩為培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)30d）接入土中，接菌量為12g／m2。每667m2施入純氮9kg、P2O54.5kg、K2O 13.5kg（尿素、碳酸氫銨、過磷酸鈣、碳酸氫鉀、硫酸鉀等分別按所需用量折算。）以基肥施用，再以相同的施用量分兩次進行追肥，以不施用肥料為空白對照，以溝施25%嘧菌酯懸浮劑為對照（各種處理詳見表1）。每處理3次重復(fù)，于苗期和收獲期分別調(diào)查地下莖及塊莖發(fā)病率，調(diào)查病級，計算病情指數(shù)以及防效（同上），對每個小區(qū)塊莖進行稱量。運用SAS軟件進行統(tǒng)計分析。

2010年于呼和浩特市武川縣大豆鋪村進行覆膜、不覆膜對碳酸氫銨與碳酸氫鉀混配防病效果影響試驗，小區(qū)設(shè)計、接菌情況、種植方法同上，試驗處理分別為CH1、CH2、N1、N2（表1）。每處理3次重復(fù)，分別于苗期和收獲期調(diào)查地下莖及塊莖發(fā)病率，調(diào)查病級并計算病情指數(shù)及防效（同上），對每小區(qū)塊莖進行稱量。運用SAS軟件進行統(tǒng)計分析。

表1 田間施肥種類及用量

1.8 田間防治試驗

試驗于2010年在呼和浩特市武川縣大豆鋪村進行。試驗田設(shè)在前茬為馬鈴薯黑痣病發(fā)病較重地塊，施肥用量同上，分覆膜和不覆膜兩種栽培方式，每小區(qū)面積66m2，隨機排列，寬窄行種植（寬行行距70cm，窄行行距40cm），每處理3次重復(fù)，于苗期和收獲期分別調(diào)查馬鈴薯地下莖及塊莖發(fā)病率，調(diào)查病級并計算病情指數(shù)以及防效（同上），每小區(qū)隨機調(diào)查20株，并對20株馬鈴薯塊莖進行稱量。運用SAS軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳酸氫銨和碳酸氫鉀抑菌作用

從表2可知，碳酸氫銨對馬鈴薯黑痣病菌菌絲生長具有較好的抑制效果，EC50僅為0.71g／L，碳酸氫鉀抑菌效果較差，EC50為3.8g／L；從圖1可知在PSA培養(yǎng)基中同時加入0.79g／L碳酸氫銨、1g／L碳酸氫鉀與在PSA培養(yǎng)基中含1.58g／L碳酸氫銨的抑菌效果是一樣的，但超過PSA培養(yǎng)基中含0.79g／L碳酸氫銨、2g／L碳酸氫鉀的抑菌效果，表明碳酸氫銨濃度一定時，加入碳酸氫鉀能夠增強抑菌作用，因此在田間防治試驗中，選用碳酸氫銨、碳酸氫鉀共同防治馬鈴薯黑痣病。

黑痣病菌菌絲生長的抑制作用1）

表2 碳酸氫銨和碳酸氫鉀對馬鈴薯

圖1 碳酸氫銨和碳酸氫鉀混合抑菌效果

2.2 盆栽試驗

由表3可知，碳酸氫銨對馬鈴薯黑痣病有明顯的防治效果，苗期地下莖病情指數(shù)僅為26.7，相對尿素的防效為40.9%；收獲期塊莖病情指數(shù)僅為23.0，相對尿素的防效為63.4%，平均單株產(chǎn)量173.7g，相對尿素增產(chǎn)9%；尿素處理苗期和收獲期的發(fā)病率、病情指數(shù)與對照之間均無顯著性差異，說明尿素對黑痣病無防治作用。

表3 盆栽試驗碳酸氫銨對馬鈴薯黑痣病防治效果1）

2.3 田間接菌防治試驗

由2009、2010年數(shù)據(jù)（表4）表明，在苗期，碳酸氫銨與碳酸氫鉀混配對馬鈴薯黑痣病有明顯的防治作用，尿素、專用肥、對照的地下莖發(fā)病率較高，均在96.7%以上，而嘧菌酯和碳酸氫銨與碳酸氫鉀混配的發(fā)病率顯著降到80.0%以下；專用肥相對尿素的防效2年數(shù)據(jù)分別為12.4%和15.4%，嘧菌酯、碳酸氫銨與碳酸氫鉀混配的防效相對尿素都達到50.0%以上。在收獲期，尿素、專用肥、對照的塊莖發(fā)病率較高，均在95.0%以上，而嘧菌酯、碳酸氫銨與碳酸氫鉀混配的發(fā)病率降到88.1%以下，有效減少了翌年初侵染源菌量；專用肥相對尿素具有較弱的防效，2009年僅為2.0%，而嘧菌酯與碳酸氫銨與碳酸氫鉀混配的防效都在21.8%以上，有效地控制了病原菌在塊莖表面形成菌核；嘧菌酯和碳酸氫銨與碳酸氫鉀混配相對尿素增產(chǎn)明顯，均達到10.7%以上，說明碳酸氫銨與碳酸氫鉀混配可抑制病原菌的生長和菌核的形成（圖2），減輕病原菌對植株生長的影響，從而提高產(chǎn)量。

圖2 尿素和碳酸氫銨與碳酸氫鉀混配對薯塊菌核形成的影響

表4 碳酸氫銨與碳酸氫鉀混配對馬鈴薯黑痣病田間防治效果1）

由表5可知，對于尿素處理，覆膜與不覆膜的發(fā)病率沒有顯著性差異，苗期地下莖覆膜的病情指數(shù)顯著高于不覆膜的病情指數(shù)，說明覆膜可能加重該病的發(fā)生，但具有一定的增產(chǎn)功能。碳酸氫銨與碳酸氫鉀混配處理：不覆膜苗期地下莖的發(fā)病率為76.7%，防效為12.7%；而覆膜的發(fā)病率顯著降低（43.3%），防效提高到47.0%；不覆膜收獲期塊莖的發(fā)病率為80.6%，防效為17.6%；而覆膜的發(fā)病率為51.8%，防效增加到41.6%，不覆膜產(chǎn)量相對N2增產(chǎn)17.6%，而覆膜產(chǎn)量相對N2增產(chǎn)24.6%，說明覆膜減輕了該病的發(fā)生程度，同時具有一定的增產(chǎn)功能。

表5 覆膜對碳酸氫銨與碳酸氫鉀混配防治馬鈴薯黑痣病效果的影響1）

2.4 田間防治試驗

根據(jù)田間苗期地下莖病害調(diào)查并結(jié)合圖3分析，在不覆膜試驗中，施用尿素、專用肥及空白對照的發(fā)病率較高，分別為46.7%、28.3%、45%，其對應(yīng)的病情指數(shù)也較高，分別為15.4、12.1、19.6；施用嘧菌酯、碳酸氫銨與碳酸氫鉀混配的發(fā)病率分別是16.7%、30%，而其對應(yīng)的病情指數(shù)分別降至4.2、7.5；覆膜與不覆膜對病害的發(fā)生影響都較小，嘧菌酯、尿素、專用肥以及空白對照等處理中覆膜的病情指數(shù)均高于不覆膜的病情指數(shù)，碳酸氫銨與碳酸氫鉀混配處理的卻相反。

根據(jù)田間收獲期塊莖病害調(diào)查并結(jié)合圖4分析，在不覆膜試驗中，施用尿素、專用肥以及空白對照的發(fā)病率較高，分別為54.3%、44.1%、52.9%，其對應(yīng)的病情指數(shù)也較高，分別為26.2、21.3、26.5，相應(yīng)的平均20株馬鈴薯產(chǎn)量分別為12.0、14.0、7.2kg；施用嘧菌酯、碳酸氫銨與碳酸氫鉀混配的發(fā)病率分別為12.1%、26.2%，而其對應(yīng)的病情指數(shù)分別降至4.7、11.6，相應(yīng)的平均20株馬鈴薯產(chǎn)量分別為18.0、14.8kg，相對尿素具有一定的增產(chǎn)效果；覆膜與不覆膜對病害的發(fā)生影響較小，病害發(fā)生趨勢與上述相同，但覆膜的產(chǎn)量均高于不覆膜的產(chǎn)量。

3 結(jié)論與討論

通過本研究證明，在PSA培養(yǎng)基中同時加入0.79g／L碳酸氫銨、1g／L碳酸氫鉀與在PSA培養(yǎng)基中含1.58g／L碳酸氫銨的抑菌效果一樣，但超過PSA培養(yǎng)基中含0.79g／L碳酸氫銨、2g／L碳酸氫鉀的抑菌效果，由此說明碳酸氫鉀可提高碳酸氫銨對立枯絲核菌抑制效果。如果生產(chǎn)中碳酸氫銨和碳酸氫鉀復(fù)合使用，既可防治黑痣病，又可為馬鈴薯提供氮肥和鉀肥，一舉兩得。經(jīng)2009、2010年田間試驗充分證明了尿素對黑痣病的發(fā)生沒有防治效果，而碳酸氫銨與碳酸氫鉀混配對馬鈴薯黑痣病有良好的防治作用；尿素、專用肥、嘧菌酯、對照等處理覆膜處理后可能通過提高土壤的溫度，促進病原菌生長，使黑痣病發(fā)生程度嚴重于不覆膜處理，而碳酸氫銨與碳酸氫鉀混配處理中，覆膜的發(fā)病率、病情指數(shù)均低于不覆膜的處理，可能是由于被地膜封閉的氨氣對病原菌有抑制作用，從而使病害發(fā)生程度顯著減輕。

目前碳酸鹽和碳酸氫鹽主要用于食品添加劑、防治采后病害較多，而用于防治土傳病害尚未見報道。通過本研究證明，碳酸氫銨與碳酸氫鉀混配對馬鈴薯黑痣病均有良好的防治作用。USEPA［18]（美國環(huán)保局）認為使用該鹽類物質(zhì)對環(huán)境和人類是安全的，并且在未來的農(nóng)業(yè)發(fā)展中，碳酸鹽或碳酸氫鹽進一步使用會使化學(xué)農(nóng)藥的使用量明顯減少。所以使用碳酸氫銨與碳酸氫鉀防治病害發(fā)生是一種良好的綠色防病方法。

目前研究資料顯示，碳酸鹽和碳酸氫鹽在一些果蔬采后病害的防治中起到了一定的作用，但其抑菌機理研究很少并且不夠深入。碳酸鹽在0.2%～3%濃度水平下會改變馬鈴薯銀腐病菌（Helminthosporium solani）膜的通透性和抑制氧化磷酸化作用［20]；Aharoni等［11]認為碳酸鹽對鏈格孢（Alternaria alternata）抑制作用可能是由于降低細胞的膨壓，導(dǎo)致菌絲和孢子失水瓦解，最終抑制其繁殖；Palou等［13]認為其抑菌機理是通過改變環(huán)境pH從而抑制真菌的生長；唐靜等［26]認為可能是由于碳酸根或碳酸氫根離子抑制了真菌菌絲的生長。作者在研究馬鈴薯黑痣病菌生物學(xué)特性中發(fā)現(xiàn)，碳酸氫銨在濃度較低的水平下，對該病菌有良好的抑制作用，同時田間防治覆膜處理會減輕病害的發(fā)生，這可能是碳酸氫銨揮發(fā)的氨氣被地膜封閉，氨氣對病原菌有抑制作用，從而使病害發(fā)生程度顯著減輕，但這種推理還需要通過進一步研究證實。

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