北京地區(qū)番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性檢測

李興紅， 喬廣行， 黃金寶， 林 雪， 劉建華＊

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京 100097；2.北京市大興區(qū)植保植檢站，北京 102600）

由灰葡萄孢（BotrytiscinereaPer.ex Fr.）引起的番茄灰霉病是保護(hù)地番茄上的重要病害，在春季發(fā)生，主要引起果實(shí)腐爛，也危害葉片和花，嚴(yán)重時(shí)造成減產(chǎn)30%～50%?；瘜W(xué)防治是防治番茄灰霉病的重要手段之一，所使用的殺菌劑主要有苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、氨基甲酸酯類及其混劑和苯胺基嘧啶類等。在生產(chǎn)上灰霉病菌對殺菌劑多菌靈、腐霉利和乙霉威等產(chǎn)生抗藥性非常普遍［1－4］，目前生產(chǎn)上控制番茄灰霉病菌的藥劑主要是嘧霉胺及復(fù)配制劑。

嘧霉胺屬于苯胺基嘧啶類殺菌劑，20世紀(jì)80年代初由安萬特公司研發(fā)成為產(chǎn)品問世。1998年在中國登記商品施佳樂原藥，目前已在中國登記的有20%和40%嘧霉胺可濕性粉劑，對由灰葡萄孢引起的灰霉病有良好的抑制作用［5］。

苯胺基嘧啶類殺菌劑作用位點(diǎn)單一，灰葡萄孢對嘧霉胺的抗藥性為單基因抗性［6］，抗藥性風(fēng)險(xiǎn)高。嘧霉胺自1998年開始在中國使用后4年，紀(jì)明山報(bào)道了遼寧省番茄灰霉病菌對嘧霉胺產(chǎn)生了抗藥性［7］，江蘇［8］、浙江［9］也相繼報(bào)道了灰葡萄孢對嘧霉胺產(chǎn)生了抗藥性。

北京地區(qū)番茄灰霉病害的發(fā)生和危害也十分嚴(yán)重，目前生產(chǎn)上主要使用嘧霉胺等殺菌劑防治，北京地區(qū)番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性如何，生產(chǎn)上應(yīng)如何合理用藥，針對該問題作者于2009年12月—2010年5月間對北京12個(gè)郊區(qū)縣番茄灰霉病菌對嘧霉胺抗藥性進(jìn)行了檢測，以明確番茄灰霉病菌對該類藥劑的抗藥性水平，為正確指導(dǎo)農(nóng)民用藥，減緩病原菌抗藥性的產(chǎn)生提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株的采集與分離

2009年12月－2010年5月，在北京12個(gè)郊區(qū)縣日光溫室或塑料大棚內(nèi)，采集番茄病樣150個(gè)，將病樣保濕產(chǎn)生新鮮的子實(shí)層，從中挑取單個(gè)分生孢子進(jìn)行培養(yǎng)，純化得到109個(gè)單孢菌株（表1），斜面和濾紙片法低溫（－20℃）保存，供抗藥性測定使用。

1.2 供試藥劑與培養(yǎng)基

將95%嘧霉胺原粉（由江蘇利民化工股份有限公司提供）溶于丙酮，配制10 000μg／mL的母液，置于4℃冰箱中存放備用。

L－asp培養(yǎng)基：K2HPO4、MgSO4·7H2O各1g分別溶于30mL去離子水中，將兩者混合后用10mol／L HCl溶解沉淀物，KCl 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，天冬酰胺2g，葡萄糖22g，瓊脂20g，加蒸餾水至1L。

1.3 含藥培養(yǎng)基制備

將嘧霉胺母液系列稀釋，按一定的比例加入到培養(yǎng)基中，制成系列濃度的含藥培養(yǎng)基（在培養(yǎng)基滅菌后，溫度降到40℃左右時(shí)加入藥劑）。

1.4 番茄灰霉病菌對嘧霉胺敏感性的測定

采用菌絲生長速率法，將所有單孢菌株在含藥平板上進(jìn)行對嘧霉胺的抗藥性測定?？顾幮詼y定設(shè)置5～7個(gè)梯度濃度，以不加藥劑的為對照；每處理重復(fù)3次；在新鮮的菌落邊緣打取直徑5mm的菌餅，接種于含藥培養(yǎng)基的平板中央，在23℃黑暗培養(yǎng)72h，測量菌落直徑。根據(jù)菌落在不同濃度藥劑平板上的線性生長速率，計(jì)算出各濃度下對病原菌的生長抑制率，用統(tǒng)計(jì)軟件DPS進(jìn)行處理，求出EC50值（抑制中濃度）、EC90值、毒力回歸方程及相關(guān)系數(shù)，并統(tǒng)計(jì)各地區(qū)的敏感抗性菌株的發(fā)生頻率。

表1 供試番茄灰霉病菌菌株及其來源

1.5 抗藥性程度劃分標(biāo)準(zhǔn)

抗性水平依據(jù)紀(jì)明山等［7］的敏感基線值（0.091 1μg／mL）進(jìn)行判別，當(dāng)菌株的EC50值小于敏感基線的5倍時(shí)，即EC50小于0.455 5μg／mL時(shí)為敏感菌株；當(dāng)菌株的EC50值處于敏感基線的5倍和10倍之間時(shí)，即EC50在0.455 5～0.911μg／mL之間時(shí)為低抗菌株，當(dāng)菌株的EC50值處于敏感基線10倍和40倍之間，即EC50在0.911～3.644μg／mL時(shí)為中抗菌株；當(dāng)某菌株的EC50值大于敏感基線的40倍，即EC50高于3.644μg／mL時(shí)為高抗菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 北京地區(qū)灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性

經(jīng)分離共獲得109株番茄灰霉病菌，采用菌絲生長速率法測定嘧霉胺對各菌株的EC50值。結(jié)果表明（表1）：北京地區(qū)郊區(qū)縣的番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性已經(jīng)產(chǎn)生分化，抗性比例較高，抗性菌株出現(xiàn)的比例高達(dá)82.57%，其中高抗菌株為主所占比例為65.14%，其次為低抗菌株和中抗菌株，分離比例分別為10.09%和7.34%；敏感菌株所占比例為17.43%?？剐跃昕剐运阶罡叩腂JPGngx15－1EC50達(dá)到257.390 3μg／mL，與最敏感菌株相比（EC50為0.050 5μg／mL），EC50值是敏感菌株的5 096倍。說明北京地區(qū)番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗性非常普遍，且以高抗菌株為主；在該地區(qū)應(yīng)采用新型替代藥劑。

表2 北京地區(qū)番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗性表型及其頻率1）

1）HR表示高抗，MR表示中抗，LR表示低抗，S表示敏感。

2.2 北京地區(qū)不同區(qū)、縣番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗性差異

比較北京地區(qū)各郊區(qū)縣抗嘧霉胺番茄灰霉菌株的頻率和程度，結(jié)果顯示（圖1）：不同郊縣番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性存在明顯差異，這可能與各區(qū)縣的種植方式和用藥水平有關(guān)。門頭溝區(qū)、密云縣、延慶縣、懷柔區(qū)和平谷區(qū)番茄灰霉病菌存在抗性問題較為突出，抗性菌株發(fā)生頻率均為100%，抗性程度也較高，高抗菌株所占比例在80%以上；通州區(qū)的抗性菌株發(fā)生頻率為95%，且都為高抗菌株，5%的菌株為敏感菌株；與之相反，海淀區(qū)和朝陽區(qū)的菌株均為敏感菌株；房山區(qū)、大興區(qū)、順義區(qū)和昌平區(qū)的抗性菌株頻率居中，依次為54.55%、77.78%、85%和88.88%；其中，房山區(qū)的抗性菌株中未出現(xiàn)高抗菌株，而后3個(gè)區(qū)的抗性菌株中以高抗菌株為主，所占比例分別為66.67%、70%和44.44%。

圖1 北京市不同區(qū)縣番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，北京地區(qū)自20世紀(jì)末開始使用嘧霉胺防治番茄灰霉病，在10余年的時(shí)間內(nèi)，番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性非常普遍，抗性菌株出現(xiàn)的比例高達(dá)82.57%，抗性水平以高抗為主，在抗性菌株中，高抗菌株所占比例達(dá)78.89%，抗性水平最高的菌株EC50是最敏感菌株EC50值的5 096倍；不同區(qū)縣番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性存在差異，這可能與番茄種植方式和用藥水平有關(guān)，海淀區(qū)、朝陽區(qū)未檢測到抗性菌株，房山區(qū)未檢測到高抗菌株，這兩區(qū)的病樣分別采自巨山農(nóng)場、朝陽農(nóng)藝園和韓村河蔬菜基地，巨山農(nóng)場是有機(jī)農(nóng)場，朝陽農(nóng)藝園和韓村河蔬菜基地都是加溫溫室，灰霉病發(fā)生較輕，用藥較少；而門頭溝區(qū)、密云縣、延慶縣、懷柔區(qū)、平谷區(qū)、大興、順義和通州等區(qū)縣的番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性普遍，抗性水平高，這些地區(qū)番茄主要是不加溫日光溫室栽培，灰霉病防治多采用嘧霉胺，藥劑的長期施用對病菌的選擇壓力導(dǎo)致抗藥性產(chǎn)生。

灰葡萄孢對嘧霉胺的抗藥性是由單基因抗性控制［6］，易形成抗藥性，這種現(xiàn)象在國內(nèi)外生產(chǎn)實(shí)踐中得到證實(shí)，本研究結(jié)果與相關(guān)報(bào)道相符。

有研究表明，灰霉病菌對嘧霉胺的抗性可穩(wěn)定遺傳，抗性菌株與敏感菌株的適應(yīng)性無差異，表現(xiàn)在菌絲生長和產(chǎn)孢能力等方面，因此，嘧霉胺在北京地區(qū)防治番茄灰霉病應(yīng)慎重使用，抗性嚴(yán)重的門頭溝區(qū)、密云縣、延慶縣、懷柔區(qū)和平谷區(qū)、通州等區(qū)縣應(yīng)停用，使用替代型殺菌劑及其他生態(tài)措施和生物農(nóng)藥；在抗性水平低的區(qū)縣應(yīng)減少嘧霉胺的使用量，交替使用新型殺菌劑及其他生物、生態(tài)等綜合控制技術(shù)，減緩抗藥性的產(chǎn)生。

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