紅瑞木潰瘍病病原菌的鑒定

羅卿權， 徐 穎＊， 劉 美

（1.上海市園林科學研究所，上海 200232；2.河南科技大學，洛陽 471023）

紅瑞木（Cornus alba Opiz）是山茱萸科梾木屬落葉花灌木，其枝干初期黃綠色，逐漸變紅，花與果實白色為主，葉片綠色，深秋轉紅，整株全年均具有觀賞價值，是園林造景中優(yōu)良的彩葉樹種。因其適應性強，極具觀賞性，國內(nèi)已廣泛種植。

近幾年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，上海辰山植物園紅瑞木上有一種新的枝干病害發(fā)生，該病導致枝干潰瘍，嚴重者甚至導致植株枯萎死亡，2010年發(fā)病率已超過30%，造成嚴重的景觀和經(jīng)濟損失。然而，國內(nèi)外關于紅瑞木病害的研究極其匱乏，該類型枝干病害未見研究報道。因此，明確紅瑞木枝干潰瘍病病原菌種類對于該病害的預防與控制具有重要意義。本研究對紅瑞木枝干潰瘍病的危害和癥狀等進行了觀察和病原菌分離，并利用傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定，結合核糖體DNA內(nèi)部轉錄間隔區(qū)（ITS，internal transcribed spacer）序列的測定分析，對病原菌進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 采樣與分離

從上海辰山植物園紅瑞木上采集發(fā)病枝干，對癥狀典型的病枝進行病原菌分離及純化［1]：取發(fā)病枝干的病健交界處5mm×3mm組織塊18塊，70%乙醇消毒2～3s，5%次氯酸鈉消毒2min，在無菌水中漂洗3次后晾干，置于含1%乳酸的PDA平板上，25℃恒溫培養(yǎng)，3d后挑取組織塊周圍的菌絲轉皿培養(yǎng)、純化，對分離物歸類、編號和轉管保存。

1.2 致病性測定

將分離獲得的真菌于PDA平板上活化培養(yǎng)2～3d，用直徑7mm打孔器在PDA平板上打取菌餅。選取健康紅瑞木，刺傷主干基部，將菌餅正面朝向傷口，用已浸濕無菌水脫脂棉保濕。每個菌株設3個重復，并設置清水對照。接種后3～5d觀察發(fā)病情況，并對發(fā)病枝條進行病原菌再分離。

1.3 病原菌形態(tài)特征觀察

將致病菌株轉接到PDA平板上，于25℃恒溫培養(yǎng)30～40d，觀察菌落形態(tài)特征，在光學顯微鏡下觀察病原菌分生孢子和分生孢子梗形態(tài)，并測量其大小。根據(jù)病原菌形態(tài)特征，進行病原菌鑒定。

1.4 病原菌rDNA－ITS的PCR擴增與序列分析

1.4.1 基因組DNA提取

將致病菌株轉接到PDA平板上，于25℃培養(yǎng)3～5d，在平板上倒入液氮，用滅菌的載玻片刮取菌絲，研缽研磨，采用改良的CTAB法提取基因組 DNA［2]。

1.4.2 rDNA－ITS PCR擴增和純化

采用真菌核糖體rDNA ITS區(qū)域通用引物ITS1－fungl和ITS4進行PCR擴增，引物序列如下：ITS1－fungl （5′－CTTGGTCATTTTAGAGGAAGTAA－3′），ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）。PCR反應體系總體積25μL，包括：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP mix（各 25mmol／L）2μL，MgCl2（25mmol／L）1.5μL，引物ITS1－fungl／ITS4（20μmol／L）各 0.5μL，DNA 模 板 0.5μL（50ng／μL），rTaq（5U／μL）0.125μL。反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性15s，50℃退火45s，72℃延伸45s，35個循環(huán)；72℃延伸5min。

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并用DNA凝膠回收試劑盒（Axygen）切膠純化后獲得目的基因片段。

1.4.3 目的片段的克隆

經(jīng)凝膠純化后的DNA片段通過pMD19－T Vector載體（TaKaRa）轉入到JM109大腸桿菌感受態(tài)細胞中進行克隆，藍白斑篩選后獲得陽性單克隆。

1.4.4 病原菌rDNA－ITS序列分析

將單克隆送往上海生工生物技術有限公司測序，測序結果在NCBI GenBank（http：∥www.ncbi.nlm.gov）中運用Blast進行同源比對，并運用clustalX2.0和 Mega5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，向Gen－Bank提交基因序列。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀觀察

該病在上海發(fā)生始于5月底至6月初，發(fā)病初期受害枝條局部出現(xiàn)壞死病斑，呈黑褐色，病斑會逐步擴展成片（圖1a），葉片隨之枯萎。病情擴展后，病斑所在枝干將逐漸枯死，如所在枝干為植物主干，甚至導致整株枯萎死亡。

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 病原菌分離、純化

將病組織置于PDA平板上25℃恒溫培養(yǎng)后，所有病組織在2～3d內(nèi)長出菌落，共分離得到3種類型真菌，其中14個病組織周圍生長出相似的灰白色菌落，40d左右開始產(chǎn)生分生孢子；3個病組織周圍生長出黑褐色菌落，7d后產(chǎn)生分生孢子，1個病組織周圍生長出白色菌落，未產(chǎn)孢。采用單孢分離法對產(chǎn)孢真菌進行純化，不產(chǎn)孢真菌采用多次挑取菌落邊緣菌絲轉皿純化，3類真菌菌株依次編號為LMF1、LMF2、LMF3，轉管保存。

2.2.2 致病性測定

將分離所得的3類菌株均于室外接種到活體紅瑞木植株上，5d后觀察發(fā)現(xiàn)，僅菌株LMF1接種植株發(fā)病，對照未發(fā)病。發(fā)病植株接種位置出現(xiàn)黑色病斑，枝干葉片明顯枯萎。對接種發(fā)病后病斑進行再分離，獲得與原分離菌株一致的病原菌。根據(jù)柯赫氏法則，試驗中分離的LMF1菌株為該病的病原菌。

2.2.3 病原菌的形態(tài)特征

菌株LMF1在PDA上菌落呈圓形，初期菌絲白色，5～6d后呈灰白色，菌絲顏色逐漸加深，14d后呈黑色，氣生菌絲絨毛狀（圖1b）。分生孢子梗帚狀，分生孢子紡錘形，單胞，無色，長為15.0～25.0μm，寬為3.7～8.5μm（圖1c）。在培養(yǎng)基和活體上均未發(fā)現(xiàn)有性型。

圖1 紅瑞木枝干潰瘍病癥狀及病原菌形態(tài)

根據(jù)病原菌上述形態(tài)特征，參照真菌分類相關文獻［3]，發(fā)現(xiàn)其符合葡萄座腔菌屬葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）菌落特征。

2.3 病原菌核糖體DNA－ITS序列分析

采用真菌rDNA ITS區(qū)域通用引物ITS1－fungl和ITS4引物對LMF1菌株基因組DNA進行PCR擴增獲得了1條600bp左右的清晰條帶。將目標條帶回收純化，克隆測序后得到了長度為628bp的rDNA－ITS序列。將該序列（已提交GenBank，登錄號：JN638454）在GenBank中進行Blast同源性比對，結果顯示所測的序列與葡萄座腔菌（B.dothidea）的相似性為99%，與葡萄座腔菌菌株（登錄號：AJ938005.1）相似性最高，達到99.36%。經(jīng)CLUSTAL2.0軟件進行序列位置對齊，并用MEGA5.0軟件采用 Maximum Likelihood法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。聚類分析結果表明，所測菌株LMF1菌株序列與GenBank中B.dothidea（GenBank登錄號：AJ938005、AB645746）的遺傳距離最近，位于子系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支（圖2）。同源性比對數(shù)據(jù)和系統(tǒng)發(fā)育樹位置進一步證明了紅瑞木枝干潰瘍病的病原菌為葡萄座腔菌。

圖2 基于GenBank數(shù)據(jù)庫的系統(tǒng)發(fā)育樹構建

3 討論

葡萄座腔菌寄主廣泛，分布遍及全球，其寄主種類多達45個屬，侵染危害蘋果、葡萄、松、黑莓、獼猴桃、桃、橄欖、桉樹、鵝耳櫪、芒果等多種重要經(jīng)濟林木［4－8]。該菌是七葉樹屬、白蠟屬、蘋果屬、楊屬、李屬、櫟屬、松屬、山梅花屬等木本植物上最常見的一種病原菌，能夠引起葉斑病、壞死病，主干或側枝潰瘍病、干腐病，果實輪紋病等多種病害。在我國，有該菌危害導致楊樹潰瘍?。?]、楊梅根腐病［10]、楓香干腐?。?1]、蘋果樹干腐病、李樹流膠病［12]、灰棗紅點軟腐?。?3]等報道。

葡萄座腔菌屬無性型在自然界中較常見，有性型少見，因此該屬形態(tài)分類學鑒定主要基于無性型的特征［14]。但由于無性態(tài)的多樣性增加了鑒定難度，傳統(tǒng)真菌形態(tài)分類方法常與分子生物學技術（rDNA－ITS）相結合［15]。

ITS區(qū)域因其在真菌的種間存在著豐富的變異，在種內(nèi)不同菌株間卻高度保守，可以為真菌的系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定提供豐富的遺傳信息，已廣泛應用于病原菌的分類鑒定和檢測。本研究利用形態(tài)學方法結合rDNA－ITS序列分析對引起紅瑞木枝干潰瘍的病原菌進行鑒定，將其鑒定為葡萄座腔菌（B.dothidea），為紅瑞木病害的防治研究提供了理論依據(jù)。葡萄座腔菌導致紅瑞木枝干潰瘍病害，目前在國內(nèi)外尚屬首次報道。

在進行形態(tài)鑒定時，本研究僅觀察到了葡萄座腔菌無性態(tài)，且培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)病原菌在PDA培養(yǎng)基上極不容易產(chǎn)生分生孢子器，產(chǎn)孢時間較長，超過30d。傳統(tǒng)方法顯示出耗時長，鑒定難度較大的弊端。同時，用分子生物學技術（rDNA－ITS鑒定技術）對病原菌進行鑒定，體現(xiàn)出操作簡單、快速的優(yōu)點，且結果與形態(tài)學方法結果一致。盡管rDNA－ITS鑒定技術顯示出極大的優(yōu)越性，但ITS區(qū)域是中等保守的，在系統(tǒng)分類時，提供數(shù)據(jù)有限，不能充分顯示種間細微差距。有研究表明Botryosphaeria屬部分種間ITS序列無明顯多樣性，種間關系需多基因聯(lián)合分析［16]。因此，分類鑒定時可利用rDNA－ITS鑒定技術快速獲得結果，并與形態(tài)學方法相互驗證。

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