華北大黑鰓金龜氣味受體OrCo基因的克隆及序列分析

王 冰， 尹 姣， 李克斌， 曹雅忠

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，北京 100193）

昆蟲在長期進(jìn)化過程中形成靈敏的嗅覺機(jī)制，以適應(yīng)復(fù)雜多變的環(huán)境條件，從而得以生存繁衍。昆蟲對氣味分子的識別和鑒定包括一系列的過程，即脂溶性小分子化合物的氣味物質(zhì)借助氣味結(jié)合蛋白（odorant－binding proteins，OBPs）等小分子量觸角蛋白的攜帶，穿過氣—液相界面到達(dá)嗅覺受體（olfactory receptors，ORs），在觸角嗅覺受體內(nèi)完成對氣味的識別［1－2]。1981年昆蟲氣味分子結(jié)合蛋白的發(fā)現(xiàn)以及其功能探討，邁出了對嗅覺機(jī)制研究的第一步［3]。1991年，Buck和Axel首次在哺乳動物鼠中分離出了嗅覺受體［4]。而昆蟲嗅覺受體的研究起步較晚，1999年在黑腹果蠅（Drosophila mela－nogaster）中發(fā)現(xiàn)了第一個昆蟲氣味受體［5]，為昆蟲嗅覺蛋白功能的研究以及氣味分子識別機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。昆蟲氣味受體分為傳統(tǒng)氣味受體（conventional receptor）和OrCo（曾經(jīng)被稱為Or83b）受體（olfactory receptor coreceptor）［6]。前 者 基 因 在 不同昆蟲間同源性較低，目前已有的研究顯示只在較小部分昆蟲物種間獲得；而后者基因是一類非典型氣味受體，在不同種間高度保守，與傳統(tǒng)的氣味受體共同行使嗅覺功能［7－9]。同時也有研究表明，OrCo受體對傳統(tǒng)的氣味受體在膜結(jié)構(gòu)上的正確定位起著不可或缺的作用［10]。

近年來，由于作物種植結(jié)構(gòu)和耕作制度的調(diào)整等原因?qū)е碌叵潞οx頻頻暴發(fā)，對我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全造成重大的威脅［11]。鞘翅目金龜甲類昆蟲是國內(nèi)外公認(rèn)的難以防治的土棲性害蟲，其中比較特殊的類群—華北大黑鰓金龜［Holotrichia oblita（Faldermann）]在我國發(fā)生相當(dāng)嚴(yán)重，是金龜子類害蟲中防治的難點(diǎn)［12]。金龜子類害蟲的幼蟲主要集中在地下危害，防治困難，而成蟲一般在地面活動，防治方法相對簡便，因此，尋求對成蟲的有效防治方法成為了科學(xué)家們近年來研究的熱點(diǎn)。金龜子在尋找寄主、配偶，搜尋產(chǎn)卵及生殖場所等過程中，蟲體同外界的化學(xué)信息交流密切，其中嗅覺在此過程中具有重要的作用［13]。因此，對其成蟲嗅覺系統(tǒng)的深入研究可成為控制其幼蟲為害的突破點(diǎn)。目前，現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲對成千上萬種氣味分子的識別主要依賴于氣味受體介導(dǎo)的氣味分子與嗅覺神經(jīng)的專一性結(jié)合。因此，研究氣味受體的特性、變異及專一性對于闡明嗅覺識別的分子機(jī)理是非常重要的［14－15]。本研究采用PCR克隆和RACE延伸技術(shù)獲得了華北大黑鰓金龜子非典型受體蛋白OrCo基因，并對其進(jìn)行序列分析，為深入研究華北大黑鰓金龜嗅覺機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

試蟲華北大黑鰓金龜成蟲于2011年5月在河北省滄州市郊區(qū)采集。將試蟲成蟲的觸角用刀片切下，立即置于液氮中速凍，之后于－80℃保存。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司；PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、5′－Full RACE Kit、3′－Full RACE Core Set Ver.2.0、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0試劑盒、LA Taq酶購自寶生物工程有限公司（TaKaRa）；感受態(tài)細(xì)胞Trans5αChemically Competent Cell購自全式金公司；pGEM－T Easy vector購自Promega公司；抗生素類、X－gal、IPTG購自Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。引物合成由上海生工公司完成；測序由華大基因生物技術(shù)公司完成。

1.3 試驗方法

1.3.1 華北大黑鰓金龜觸角總RNA的提取

取50頭華北大黑鰓金龜成蟲，剪下觸角，于液氮中研磨，根據(jù)Trizol提取RNA說明書提取總RNA，之后加入RNase－free水30μL，立即進(jìn)行cDNA第1鏈合成或－80℃保存。

1.3.2 cDNA第1鏈合成

以總RNA為模板，按照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第1鏈。反應(yīng)步驟如下：將下列物質(zhì)混合：Oligo dT Primer（50μmol／L）1μL，dNTP 1μL，總 RNA 6μg，RNase free dH2O 2μL，之后在PCR儀上進(jìn)行65℃5min變性、退火反應(yīng)，于冰上急冷。配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，包括5×PrimeScriptTMBuffer 4μL，RNase Inhibitor（40U／μL）0.5μL，PrimeScriptTMRTase（200U／μL）1μL，上述變性、退火后反應(yīng)液10μL，RNase Free dH2O 4.5μL，在PCR儀上按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42℃60min，70℃15min，冰上放置。將合成的cDNA于－20℃保存。

1.3.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中已經(jīng)登錄的近緣種金龜子Or－Co基因的保守區(qū)域，利用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5設(shè)計相應(yīng)的簡并引物，用于擴(kuò)增華北大黑鰓金龜OrCo受體基因的cDNA片段。3′RACE和5′RACE引物是根據(jù)cDNA擴(kuò)增片段獲得的序列而進(jìn)一步設(shè)計的。最后設(shè)計特異性引物擴(kuò)增OrCo受體基因的全長。引物序列見表1。

表1 擴(kuò)增華北大黑鰓金龜OrCo基因所用引物

1.3.4 PCR擴(kuò)增和RACE反應(yīng)

以合成的cDNA為模板，選用LATaq酶擴(kuò)增。混勻下列成分：合成的cDNA 2.5ng，dNTP Mixture 8μL（各2.5mmol／L），10×LA PCR BufferⅡ（Mg2＋free）5μL，25mmol／L MgCl25μL，正向引物和反向引物各1μL（20μmol／L），LA Taq DNA 聚 合 酶（5U／μL）0.5μL，加滅菌蒸餾水至50μL，放入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94℃變性5min；30個循環(huán)條件為94℃30s，55℃30s，72℃1min的循環(huán)；72℃延伸10min。

RACE 反應(yīng)參照5′－Full RACE Kit和 3′－Full RACE Core Set Ver.2.0說明書。擴(kuò)增的產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并對目的片段進(jìn)行回收。

1.3.5 PCR產(chǎn)物克隆及序列測定

按說明書的說明，將PCR回收產(chǎn)物連接到pGEM－T Easy vector上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans5αChemically Competent Cell，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆，之后送公司測序。

1.3.6 序列分析

Blast同源性搜索在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行，序列分析由DNAman軟件完成，跨膜域預(yù)測由TMHMM程序（http：∥www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM）完成。多序列同源性比對和結(jié)果輸出應(yīng)用Clustal 2.0.7軟件進(jìn)行。昆蟲氣味受體進(jìn)化樹的構(gòu)建使用Mega4.1軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 華北大黑鰓金龜OrCo基因的克隆

以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用簡并引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得450bp左右的片段，與pGEMT Easy vector連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α細(xì)胞，對其進(jìn)行菌液PCR，檢測片段大小正確后測序。獲得的片段序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST同源搜索，比對結(jié)果顯示該片段與鞘翅目嗅覺受體基因高度同源。根據(jù)獲得的序列分別設(shè)計3′－RACE和5′－RACE所需的特異性引物（見表1），并根據(jù)說明書進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果得到了580bp和1 300bp的特異性條帶，同樣將這些片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化與測序。

根據(jù)3′－RACE和5′－RACE測序結(jié)果，拼接獲得一個編碼華北大黑鰓金龜OrCo的cDNA序列。同時，我們設(shè)計了1對特異性引物（見表1）來證明PCR，3′－RACE和5′－RACE片段是來源于同一個基因，PCR擴(kuò)增得到了一條全長為1 598bp的序列，測序結(jié)果與拼接結(jié)果一致（圖1）。該序列蛋白編碼區(qū)長1 434bp，5′非翻譯區(qū)長203bp，3′非翻譯區(qū)不完整，但是得到了終止密碼子TAA以及多聚腺苷酸信號序列，因此蛋白編碼區(qū)是完整的。

圖1 華北大黑鰓金龜OrCo基因（Hobl／OrCo）PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 序列分析

將克隆獲得的華北大黑鰓金龜cDNA全長序列命名為Hobl／OrCo，并在GenBank注冊，登錄號為：JF718 662。如圖2所示，Hobl／OrCo基因的核苷酸序列全長共1 598bp，開放閱讀框全長1 434bp，編碼477個氨基酸。根據(jù)網(wǎng)站http：∥www.expasy.ch／tools／protparam.html預(yù)測其分子量為54.54ku，等電點(diǎn)為7.65?？缒そY(jié)構(gòu)分析（http：∥www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM）表明，Hobl／OrCo基因推斷的氨基酸序列具有7個α螺旋跨膜區(qū)，跨膜位置分別為37～59、74～96、135～157、194～216、339～361、381～403、451～473（圖3），類似于一個典型的G蛋白偶聯(lián)受體。

圖2 華北大黑鰓金龜Hobl／OrCo核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

圖3 華北大黑鰓金龜Hobl／OrCo跨膜區(qū)預(yù)測

以往的研究表明OrCo受體在昆蟲進(jìn)化過程中高度保守，因此選取已知近緣種鞘翅目的鉛灰齒爪鰓金龜（Hplu／OrCo）、赤擬谷盜（Tcas／OrCo）和黃曲條跳甲（Pstr／OrCo），以及鱗翅目、雙翅目和膜翅目具有代表性的昆蟲與其進(jìn)行序列聯(lián)配。結(jié)果顯示，Hobl／Or－Co基因的氨基酸序列與近緣種鉛灰齒爪鰓金龜（Hplu／OrCo）的同源性高達(dá)95.39%，與鞘翅目赤擬谷盜（Tcas／OrCo）同源性高達(dá)80.71%，與已經(jīng)報道的其他昆蟲的嗅覺受體同源性在76%以上，尤其在C端保守性非常高，這與以往的研究高度吻合（圖4）。

利用Mega 4.1軟件［16]構(gòu)建了鱗翅目、鞘翅目、膜翅目、雙翅目部分昆蟲非典型氣味受體的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）。經(jīng)1 000次重復(fù)后，該進(jìn)化樹非常直觀地呈現(xiàn)出4個目昆蟲之間的進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果顯示，22個OrCos分成2個大的分支，其中雙翅目和鞘翅目昆蟲處于一個分支上，而膜翅目和鱗翅目昆蟲處于另一個大分支上，說明相對于膜翅目和鱗翅目而言，雙翅目與鞘翅目在OrCo上的親緣關(guān)系較近。這4個目的氣味受體序列均表現(xiàn)得相對較為保守，未出現(xiàn)較大的分化。在鞘翅目中，大黑鰓金龜（Hobl／Or－Co）與鉛灰齒爪鰓金龜（Hplu／OrCo）的非典型氣味受體親緣關(guān)系很近，與黃曲條跳甲（Pstr／OrCo）則相對遠(yuǎn)些，這與序列聯(lián)配的結(jié)果相一致。

3 討論

對果蠅（Drosophila melanogaster）、岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）、意大利蜜蜂（Apis mellifera）、煙芽夜蛾（Heliothis virescens）、家蠶（Bombyx mori）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）和赤擬谷盜（Tribolium castaneum）等多種昆蟲研究發(fā)現(xiàn)，普通氣味受體基因在昆蟲中同源性很低［9，17－24]。但是另一類非典型氣味受體基因OrCo則不同，這類基因在不同昆蟲體內(nèi)高度保守［25]。目前，已經(jīng)在鱗翅目、膜翅目、鞘翅目、雙翅目［22，26－27]等4個目昆蟲中發(fā)現(xiàn) Or－Co的存在。本研究利用基因克隆技術(shù)成功獲得了華北大黑鰓金龜OrCo基因的cDNA全長序列，并進(jìn)行了序列分析，獲得的氨基酸序列與近緣種鉛灰齒爪鰓金龜嗅覺受體的同源性高達(dá)95%以上，與鞘翅目赤擬谷盜的同源性高達(dá)80%以上，這些都與OrCo基因在不同昆蟲體內(nèi)的高度保守性相吻合［28－33]。

目前研究顯示OrCo可加速受體與氣味分子間的相互作用［8－9，22，34]，并能輔助傳統(tǒng)氣味受體正確定位到嗅覺神經(jīng)元樹突膜上［8]。OrCo基因與傳統(tǒng)氣味受體間的互作研究，有助于發(fā)掘和研究傳統(tǒng)氣味受體的相關(guān)功能，為進(jìn)一步探索受體在氣味識別過程中所起的作用和功能提供了理論基礎(chǔ)。但是，完整的嗅覺受體信號傳導(dǎo)機(jī)制尚不清楚［35]。2008年在《nature》發(fā)表的兩篇文章提出了一種新的嗅覺傳導(dǎo)模型，即OR－OrCo和氣味化合物共同控制的離子通道［36－37]。該研究顯示昆蟲的化學(xué)傳導(dǎo)機(jī)制可能與其他脊椎動物的有所不同。經(jīng)典的G蛋白偶聯(lián)受體的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)呈現(xiàn)為：蛋白的N末端位于細(xì)胞膜外，C末端位于細(xì)胞膜內(nèi)。然而，果蠅的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)則與傳統(tǒng)的G蛋白偶聯(lián)受體相反，這樣與配體結(jié)合的ORs就受到了更多的限制［34]。如果所有果蠅的ORs都呈現(xiàn)出反向G蛋白偶聯(lián)受體的特征，那么它們將代表另一種7個跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白家族。同時，它們的信號傳導(dǎo)途徑可能與G蛋白偶聯(lián)受體不同，可能利用磷脂肌醇（IP3）信號通路抑或是環(huán)核苷酸信號通路將配體信息傳導(dǎo)到受體神經(jīng)元上，刺激電生理活動［38]。因此，當(dāng)嗅覺受體與氣味配體結(jié)合后是如何傳導(dǎo)信號的尚需進(jìn)一步的研究與驗證。

華北大黑鰓金龜OrCo受體的成功克隆，對進(jìn)一步研究華北大黑鰓金龜氣味受體的功能以及解析嗅覺機(jī)制具有重要的意義。同時，從應(yīng)用角度來看，由于OrCo基因在昆蟲中普遍存在以及其在嗅覺機(jī)制中的重要性，使其成為切斷嗅覺識別途徑的分子靶標(biāo)，對其深入研究將為農(nóng)業(yè)害蟲的防控提供新的理論基礎(chǔ)，并具有一定的實踐意義。

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