大螟幼蟲田間擴散及成蟲飛行能力研究

韓蘭芝， 彭于發(fā)， 吳孔明

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所／植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193）

轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻已在日本和東南亞的多個國家進(jìn)行了田間試驗，2005年伊朗首次批準(zhǔn)了Bt水稻的商業(yè)化種植［1]。我國也于2009年8月17日發(fā)放了轉(zhuǎn)cry1Ac／cry1Ab基因水稻（‘華恢1號’及其轉(zhuǎn)基因雜交稻‘Bt汕優(yōu)63’）在湖北省生產(chǎn)應(yīng)用的安全證書 （http：∥www.stee.agri.gov.cn／biosafety／spxx／）。一般而言，Bt殺蟲晶體蛋白的種類不同，其殺蟲譜也不同［2－4]。Bt水稻中轉(zhuǎn)入的Bt基因所表達(dá)的殺蟲蛋白對螟蛾科的靶標(biāo)害蟲二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟均具有較高的控制效果，但對夜蛾科類的大螟（又名稻蛀莖夜蛾）防效明顯下降［5－8]。有報道，轉(zhuǎn)cry1Ac＋CpTI晚稻對大螟的蟲口減退率為44%～64%，轉(zhuǎn)基因水稻田殘存鱗翅目幼蟲中，大螟所占比例明顯升高，可能會引起轉(zhuǎn)基因稻田主要害蟲構(gòu)成比例發(fā)生變化［8]。大螟對Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ba等不同Bt毒蛋白的耐受性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于二化螟［9]。由此可見，轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)業(yè)化后，大螟對Bt水稻的抗性風(fēng)險要高于二化螟等其他鱗翅目害蟲。因此，大螟的抗性治理將成為Bt水稻害蟲抗性治理研究中的重要內(nèi)容。

“高劑量／庇護(hù)所”策略是目前害蟲Bt抗性治理中被廣泛接受的主要治理措施［10－11]。其原理為在Bt作物周圍種植一些非Bt作物，作為敏感害蟲的庇護(hù)所，使敏感個體與Bt植株上的抗性個體隨機交配，產(chǎn)生的雜合子后代在Bt植株上不能存活，從而達(dá)到治理害蟲的目的。實施該策略的前提條件之一是Bt作物上的抗性個體與庇護(hù)所中的敏感個體必須自由交配［10－11]。而要實現(xiàn)該條件，必須首先了解成蟲的飛行能力，從而確定庇護(hù)所與Bt田的距離［12]。同時，庇護(hù)所與Bt稻田呈何種分布形式也是害蟲抗性治理策略中首要考慮的關(guān)鍵問題，它主要取決于幼蟲在田間的取食和運動特性［13－15]。有研究表明，非水稻寄主植物茭白、玉米和一些莎草科植物在大螟的抗性治理中可作為天然庇護(hù)所［16]，但與大螟抗性治理相關(guān)的運動行為如幼蟲在田間的遷移擴散和成蟲的飛行能力還未見報道。這些研究的系統(tǒng)開展，將有助于實施預(yù)防性的大螟抗性治理策略，對Bt水稻的可持續(xù)應(yīng)用和健康發(fā)展均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

從福州郊區(qū)水稻田采集蟲齡一致的大螟幼蟲，用稻莖在室內(nèi)飼養(yǎng)至化蛹。羽化后一部分成蟲置于移栽有水稻苗的交配籠中產(chǎn)卵，產(chǎn)卵后，將所產(chǎn)的卵塊從交配籠中取出，放入鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，直至卵塊變黑，接到田間小區(qū)，至幼蟲孵化，用于觀察其遷移擴散能力；另一部分成蟲羽化后直接用于飛行能力測試，所有試蟲的飼養(yǎng)條件均保持在（27±1）℃，70%～80%RH，L∥D＝14h∥10h。

1.2 大螟幼蟲在田間的遷移擴散能力研究

1.2.1 田間試驗小區(qū)的設(shè)置

本試驗于2006年在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院吳鳳試驗基地（福州市郊）的網(wǎng)室中進(jìn)行。供試水稻生育期分別為分蘗期和孕穗期。每一生育期測試均設(shè)置24個小區(qū)，共計48個小區(qū)，每小區(qū)面積為4m×4m。隨機區(qū)組設(shè)計，小區(qū)間隔為1m。供試水稻品種為華南稻區(qū)的主栽秈稻‘明恢86’。供試生育期為分蘗期的水稻于2006年7月15日播種，8月7日左右插秧；供試生育期為孕穗期的水稻于6月8日播種，6月30日左右插秧移栽；秧苗均為每穴單株移栽，穴間距為20cm。各試驗小區(qū)內(nèi)的水肥管理和農(nóng)事操作相同，在整個生長期內(nèi)不施任何農(nóng)藥。

1.2.2 人工接蟲及取樣方法

由于該試驗在基地的網(wǎng)室中進(jìn)行（為防止外來蟲源入侵，在網(wǎng)室外圍又加一層80目的紗網(wǎng)），插秧初期，由于紗網(wǎng)的阻隔，極少有外來蟲源的自然入侵，隨著大螟發(fā)生數(shù)量的增加，紗網(wǎng)也很難完全阻隔外來蟲源的自然入侵。因此，人工接蟲前，對每一小區(qū)的自然入侵情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)自然入侵的大螟均已發(fā)育到3～4齡，可與人工接的試蟲區(qū)別開來，故在以后的破壞性取樣記錄蟲量時，要減去自然入侵的蟲量。

分蘗期和孕穗期的人工接卵日期分別為播種后35～40d和70～75d，即8月22日前后和8月20日前后；接蟲方法：將變黑的卵塊接到每個試驗小區(qū)的中心穴上，每一中心穴接卵100～200粒左右，將卵塊放于中心穴的第2和第3個葉片之間，并做好標(biāo)記（該接蟲穴又稱作釋放穴）。接蟲后，觀察記錄每塊卵孵化的具體日期。幼蟲孵化后，每隔2d調(diào)查1次各小區(qū)的幼蟲在田間的擴散情況，若發(fā)現(xiàn)釋放穴已有試蟲擴散到鄰近的水稻穴上，則開始進(jìn)行破壞性取樣。取樣方法參照Cohen等［14]的方法并做適當(dāng)修改。每次取樣約重復(fù)3～4次。據(jù)田間觀察發(fā)現(xiàn)，在接蟲后的第8天有極少量幼蟲開始向鄰近的水稻穴上擴散，故在接蟲后的第9、12、15、22、28、33天分別取樣，這時80%左右的幼蟲已開始化蛹。取樣時，將整個小區(qū)內(nèi)的水稻穴從土中完全拔出，仔細(xì)清除根部，洗凈，并對每株水稻按距離的不同做好標(biāo)記，放入塑料袋中帶回室內(nèi)進(jìn)行剝查。若當(dāng)天來不及調(diào)查，可先放入4℃冰箱中保存，待查。在剝查時，記錄每一穴水稻中幼蟲的數(shù)量和所在位置及每一穴水稻的分蘗數(shù)。

1.3 大螟成蟲的飛行能力測定

測試儀器為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所研制的32通道昆蟲飛行數(shù)據(jù)微機采集系統(tǒng)。測試前，先用乙醚輕度麻醉大螟處女蛾，然后用毛筆輕輕刷去前胸背板的鱗片，再用502膠（蘇州化工廠研制）粘接于飛行磨吊臂的小銅絲上。供試的大螟為不同日齡的處女蛾，每次的測試時間為12h，從每天的18：00開始至次日6：00結(jié)束。測試結(jié)束后，將存活的成蟲從飛行磨上取下，放入小塑料培養(yǎng)皿中，飼喂蜂蜜水，在當(dāng)天18：00繼續(xù)進(jìn)行吊飛測試，如此一直測試到成蟲死亡或飛不動（將其放在飛行磨上，用手觸動，仍不飛）為止。飛行測試在（24±1）℃，70%～80%RH，完全黑暗的條件下進(jìn)行。整個測試過程中共吊飛163頭試蟲。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用兩個參數(shù)來描述幼蟲在田間擴散時隨時間變化的空間分布。（1）幼蟲在水稻穴上的回收率，其計算方法為取樣穴上的幼蟲數(shù)／總回收蟲數(shù)；（2）幼蟲擴散的平均距離，將在某一特定距離回收的幼蟲數(shù)分別記為n1、n2……，某一特定的擴散距離記為d1、d2……，擴散的平均距離＝（n1×d1＋n2×d2＋ni×di）／總回收蟲數(shù)。

大螟在分蘗期和孕穗期水稻上同一取樣日的平均擴散距離的比較采用t測驗；兩生育期在不同取樣日的平均擴散距離的多重比較采用Fisher氏最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行。

成蟲的飛行數(shù)據(jù)（飛行距離、時間及速度）均采用飛行磨自帶的軟件進(jìn)行初步的分析匯總后［17]，在Excel中計算其平均飛行距離、平均飛行持續(xù)時間及平均飛行速度。進(jìn)行多重比較之前，需將成蟲的飛行數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，經(jīng)正態(tài)性檢驗后，用Fisher氏最小顯著差數(shù)法（LSD）對不同日齡成蟲的平均飛行能力進(jìn)行差異顯著性比較。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析均在SAS軟件上完成［18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大螟幼蟲在田間的遷移擴散能力

在分蘗期和孕穗期的水稻上，接蟲后的1～7d幼蟲均在釋放穴的分蘗上擴散；接蟲后第8天，少量幼蟲開始向鄰近穴擴散；接蟲后的第9天，約27.8%和17.3%的幼蟲分別擴散到距離釋放穴20cm處的鄰近穴上；到第12天，已分別有18.7%和3.4%的幼蟲擴散到距離釋放穴40cm的水稻穴上；第15天，分蘗期水稻上已有7.3%的幼蟲擴散到距離釋放穴60cm處的水稻穴上；第22天，分蘗期水稻上已分別有15.6%和9.0%的幼蟲擴散到距離釋放處80cm和100cm的水稻穴上；而在孕穗期水稻上，只有8.2%的幼蟲擴散到100cm處的水稻穴上；第28天，6.4%的大螟在分蘗期水稻上擴散到120cm處，而孕穗期水稻上只有8.9%的大螟擴散到100cm的水稻穴上；第33天，約9.1%和5.9%的大螟幼蟲在分蘗期和孕穗期水稻上均擴散到120cm處（圖1）。

大螟在不同取樣時間的擴散距離差異顯著（分蘗期F＝554.33，df＝5，18，p＜0.01；孕穗期F＝347.42，df＝5，17，p＜0.01）。在整個幼蟲發(fā)育過程中，大螟在分蘗期和孕穗期水稻上所能擴散的最遠(yuǎn)距離均為120cm，平均擴散距離分別為62.29cm和51.02cm。且大螟在分蘗期水稻上不同取樣日期的擴散距離均顯著高于孕穗期（t＝2.97，df＝3，3，p＜0.05，第9天；t＝4.56，df＝3，3，p＜0.01，第12天；t＝8.05，df＝3，3，p＜0.01，第22天；t＝6.15，df＝3，3，p＜0.01，第28天；t＝7.06，df＝3，3，p＜0.01，第33天）（表1，圖1）。

表1 大螟幼蟲在田間的平均擴散距離1）

接蟲后1～9d，大多數(shù)幼蟲均在3齡以下，在釋放穴上的數(shù)量變化較小；接蟲12d后，大多數(shù)幼蟲發(fā)育到3齡以上，釋放穴上的蟲量顯著下降，至33d在分蘗期和孕穗期水稻釋放穴上的蟲量僅有5.6%和17.9%，且大多數(shù)均為一直在釋放穴上取食的幼蟲，即將化蛹或已化蛹（圖1）。

圖1 大螟幼蟲田間遷移時隨時間變化的空間分布

2.2 大螟成蟲的持續(xù)飛行能力

持續(xù)吊飛結(jié)果表明，大螟的有效飛行時間為4～5d，能連續(xù)多次飛行。試蟲起飛比率為53.4%，其中累計能飛行12h的個體占54.0%，其累計平均飛行距離、飛行速率和飛行時間分別為5.66km、1.60km／h和3.25h；累計能飛行24h的個體占21.8%，其累計平均飛行距離、飛行速率和飛行時間分別為8.67km、2.10km／h和4.21h；約有12.6%的個體能累計飛行36h，其累計平均飛行距離和飛行時間分別達(dá)11.53km和5.44h；約有5.7%的個體能連續(xù)飛行48h，其累計平均飛行距離和飛行時間分別超過13km和6h，顯著高于連續(xù)3晚的飛行距離和時間（F＝12.20，df＝4，82，p＜0.05；F＝15.77，df＝4，82，p＜0.05）。累計飛行60h后，大多數(shù)個體已死亡，但少數(shù)個體（5.7%）仍具有一定的飛行能力。不同飛行時間的大螟平均飛行速率均以第1晚的較低，但它們之間沒有顯著差異（F＝2.25，df＝4，82，p＞0.05）（表2）。

2.3 不同日齡大螟成蟲的飛行能力

不同日齡大螟的吊飛結(jié)果表明，成蟲的飛行能力在不同日齡間存在顯著差異（表3）。初羽化成蟲就具有一定的飛行能力；2日齡時飛行能力達(dá)到最強，平均飛行距離為10.27km，顯著高于1日齡和4日齡（F＝3.00，df＝3，112，p＜0.05），平均持續(xù)飛行時間可達(dá)3.62h，顯著高于4日齡（F＝3.62，d f＝3，112，p＜0.05），平均飛行速度為3.70km／h，僅次于3日齡；3日齡的成蟲仍具有較強的飛行能力，雖然其平均飛行距離和平均飛行持續(xù)時間低于2日齡，但其平均飛行速度達(dá)到最大（5.29km／h）；4、5日齡后，成蟲的飛行能力顯著下降。

表2 持續(xù)吊飛時大螟的飛行能力

表3 大螟不同日齡處女蛾的飛行能力

3 討論

本研究結(jié)果表明，大螟幼蟲在不同水稻穴之間存在頻繁的遷移擴散行為，且在分蘗期水稻上的擴散速率顯著高于孕穗期。同樣，Cohen等［14]在研究二化螟和三化螟幼蟲在溫室和田間的擴散速率時，也發(fā)現(xiàn)兩種害蟲在分蘗期水稻上的擴散速率和距離均高于孕穗期水稻，且在溫室的擴散速率和距離高于田間。究其原因，可能與水稻植株分蘗的數(shù)量有關(guān)，一般水稻植株的分蘗數(shù)在孕穗期達(dá)到最高，其數(shù)量是分蘗期的1.1～2.0倍。另一方面大螟的擴散速率也反映了其對營養(yǎng)條件的需求狀況［14]。孕穗期的水稻生長繁茂，每個分蘗莖稈的直徑也達(dá)到最大，能給幼蟲提供更多的食物資源和生存空間［14]。因此，幼蟲有充足的食料進(jìn)行生長發(fā)育，無需為了食物而頻繁遷移，故其擴散速率和擴散距離大大降低。除此之外，田間的氣候?qū)τ紫x的遷移也有重要影響，如初孵幼蟲可以借助風(fēng)力快速地擴散；氣溫也是一個很重要的因素，溫度高，幼蟲發(fā)育速率加快，需要獲取更多的食物滿足其生長發(fā)育，因此其必須轉(zhuǎn)移到新的植株上進(jìn)行危害，從而加快了其擴散的速度和距離［14－15]。本研究還表明，在接蟲后1～9d內(nèi)，70%和80%以上的幼蟲分別分布在分蘗期和孕穗期水稻的釋放穴上，并在釋放穴的各個分蘗上擴散取食，這時幼蟲大多數(shù)還在3齡以下，取食量較小，對食物資源和生存空間的需求量較小，所以擴散速度較慢；接蟲12d后，釋放穴上的幼蟲數(shù)量顯著下降，這時幼蟲大多均發(fā)育到3齡以上，取食量顯著增大，對食物質(zhì)量、數(shù)量及生存空間的要求也增高。因此，擴散速率顯著加快。這些均說明大螟不但在穴與穴之間存在高頻次的遷移，而且在同一穴內(nèi)的不同分蘗上也存在高頻次的擴散，且擴散速率隨蟲齡的增大而加快。

大螟這種頻繁的擴散行為將直接導(dǎo)致幼蟲在Bt植株與非Bt植株間的頻繁移動，有助于加速害蟲對Bt作物的抗性進(jìn)化，這在許多模型研究中已得到證實［11，19]。雖然昆蟲在Bt與非Bt作物間的移動在一定程度上降低了選擇率，但抗性顯性度的增加遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了選擇率的降低，因此有助于加快抗性演化［19]。此外，昆蟲在Bt與非Bt作物間的移動可能影響抗性和敏感基因型個體的相對適合度。Cohen等［14]和Dirie等［15]在研究二化螟和三化螟在Bt水稻和非Bt水稻的擴散行為試驗中得出：種子混合的庇護(hù)所策略可能提高抗性個體的存活和適應(yīng)性。雖然大螟在兩生育期的水稻上的平均最大遷移距離為62.29cm和51.02cm，但均在距離釋放穴120cm處的水稻穴上回收到大螟，這說明其最大遷移距離為120cm。對害蟲抗性治理來說，如果在不同田塊之間種植非Bt水稻作為庇護(hù)所，那么害蟲的最大遷移距離也是考慮的重要因素之一［14]。因為對大齡幼蟲來說，它完全可以通過爬行等方式在不同田塊之間進(jìn)行擴散。

由于大螟成蟲白天多隱蔽、不活動［20]，故本文只模擬其晚上的飛行條件并測試其一晚的飛行距離，持續(xù)飛行能力測試的是其數(shù)晚的累計飛行距離。本研究結(jié)果表明，大螟累計飛行距離≤5km的個體占75.5%。不同日齡成蟲的飛行能力具有顯著差異，飛行能力在2日齡達(dá)到最高，3日齡仍較強，4日齡后飛行能力顯著下降，與孫建中等［20]的結(jié)果基本相符。但值得注意的是，不同日齡成蟲的起飛比例卻差異不大，均在50%左右，可見仍有一半左右的個體不能起飛。又由于大螟求偶前期特別短，羽化后當(dāng)晚或次晚就可交配，并且交配率在第2天達(dá)到最高［20－21]。因此，在用“高劑量／庇護(hù)所”策略對大螟進(jìn)行抗性治理時，為保證敏感個體與抗性個體的充分自由交配，必須考慮庇護(hù)所與Bt稻田的距離。鑒于大螟幼蟲遷移擴散能力相對較強、飛行能力相對較弱（累計飛行距離≤5.0km的個體占75.5%）和求偶前期相對較短（0～2d）的前提下，我們認(rèn)為：對大螟進(jìn)行抗性治理時，應(yīng)采用分區(qū)種植的庇護(hù)所，且庇護(hù)所與Bt稻田的距離最好不超過5.0km。

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