不同基因缺失型酵母對(duì)全氟辛酸的靈敏性

金士威，程巧紅， 戴和平

(1．武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074；2. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430072)

0 引 言

酵母是最簡(jiǎn)單的高等真核生物，是真核生物研究的模式生物.酵母在三個(gè)不同水平上調(diào)節(jié)遺傳毒性化學(xué)物在細(xì)胞內(nèi)的累積：細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的通透性以及細(xì)胞的多藥抗性機(jī)制(PDR途徑)[12].CWP1，CWP2基因編碼細(xì)胞壁苷露糖蛋白，失活可明顯提高酵母細(xì)胞壁通透性；SNQ1，SNQ2基因編碼外排泵蛋白，失活可明顯提高酵母內(nèi)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)不同分子量化學(xué)物的靈敏度；YAP1基因調(diào)控許多關(guān)鍵抗氧化基因的表達(dá)，失活可明顯提高酵母檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)DNA氧化損傷劑的能力[13].

由于全氟化合物的廣泛使用和全球的普遍污染，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始研究其在環(huán)境中的污染現(xiàn)狀、致毒機(jī)理和對(duì)人體的健康威脅.采用基于細(xì)胞培養(yǎng)的離體生物方法評(píng)估環(huán)境污染物的毒理學(xué)效應(yīng)，相比于魚(yú)類(lèi)、白鼠等活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，具有成本低、時(shí)間短、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，因此具有廣闊的應(yīng)用前景.酵母細(xì)胞屬于單細(xì)胞生物，除了缺乏哺乳動(dòng)物細(xì)胞復(fù)雜的受體系統(tǒng)外[14]，還具有易培養(yǎng)、生長(zhǎng)快、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn).本研究旨在篩選基因缺失型酵母來(lái)檢測(cè)環(huán)境中的有毒污染物，以PFOA為污染物模型，探究其對(duì)不同缺失型酵母的毒性機(jī)理.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

本實(shí)驗(yàn)PFOA為純度大于97%的固體，購(gòu)買(mǎi)自Merck公司，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液為1.0 mol/L，溶劑為二甲基亞砜(DMSO)、SD-Ura培養(yǎng)液.

SD-Ura培養(yǎng)液：酵母氮源無(wú)氨基無(wú)硫酸銨0.17%、硫酸銨 0.5%、腺嘌呤 0.2%、色氨酸 1%、組氨酸1%、亮氨酸1%、賴(lài)氨酸1%(以上百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)).

固體培養(yǎng)基加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的瓊脂粉，溶于蒸餾水中高壓滅菌后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%的葡萄糖致最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%.

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

高壓滅菌鍋(LDZX-30KBS)，上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)生產(chǎn).搖床(THZ-C)，江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng)生產(chǎn).恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司生產(chǎn).超凈工作臺(tái)(Ai Tech)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn).移液槍(eppendorf)、?90 mm培養(yǎng)皿、試管、三角瓶.

1.3 實(shí)驗(yàn)生物

本研究野生型酵母細(xì)胞BY4741和其4基因缺失型突變體(cwp1△cwp2△snq1△snq2△)、5基因缺失型突變體(cwp1△cwp2△snq1△snq2△yap1△)菌株均來(lái)自于中科院水生生物究所水生動(dòng)物蛋白質(zhì)工程學(xué)科組.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)前均將配制的SD-Ura培養(yǎng)液在高壓滅菌鍋中滅菌，把三種酵母(BY4741、4基因缺失型突變體、5基因缺失型突變體)接種到SD-Ura液體培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)16 h.第二天用SD-Ura液體培養(yǎng)基將培養(yǎng)的酵母培養(yǎng)液稀釋?zhuān)止夤舛扔?jì)檢測(cè)其OD值為0.11，繼續(xù)30 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)2 h，測(cè)其OD值為0.14時(shí)開(kāi)始染毒.染毒后的酵母培養(yǎng)液繼續(xù)30 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)4 h.取出酵母細(xì)胞培養(yǎng)液在超凈工作臺(tái)用無(wú)菌水稀釋105倍后，取100 uL涂SD-Ura固體培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天，對(duì)長(zhǎng)出的單克隆子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 DMSO溶劑對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

生物實(shí)驗(yàn)常以DMSO為污染物的載體溶劑，本實(shí)驗(yàn)探索了不同的DMSO濃度對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響.由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，當(dāng)DMSO在培養(yǎng)液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.5%時(shí)，對(duì)3類(lèi)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響；而當(dāng)DMSO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，則產(chǎn)生明顯的影響，特別是對(duì)5基因缺失型酵母突變體，影響更為顯著，其存活率降為70%.故以后的實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)液中DMSO的濃度不超過(guò)0.5%，以避免溶劑的影響.

2.2 染毒后酵母的培養(yǎng)時(shí)間與細(xì)胞生長(zhǎng)量的關(guān)系

為了驗(yàn)證酵母細(xì)胞染毒后細(xì)胞生長(zhǎng)量與培養(yǎng)時(shí)間的最佳關(guān)系，酵母細(xì)胞培養(yǎng)液在染毒后分別在30 ℃，200 r/min搖床分別培養(yǎng)0、2、4、6、8 h，隨后分別在超凈工作臺(tái)用無(wú)菌水稀釋105倍，分別取100 uL涂SD-ura固體培養(yǎng)基平板后，在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天后，對(duì)生長(zhǎng)出的單克隆子計(jì)數(shù)，其結(jié)果如圖1所示.染毒超過(guò)4 h后，酵母增殖上處于不增殖的狀態(tài)，所以本實(shí)驗(yàn)酵母細(xì)胞培養(yǎng)液染毒后繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間定為4 h.

圖1 酵母培養(yǎng)時(shí)間與酵母生長(zhǎng)量的關(guān)系Fig.1 Effect of culture time on the growth of yeast

2.3 PFOA濃度對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

酵母細(xì)胞培養(yǎng)液加PFOA后，30 ℃，200 r/min搖床繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在超凈工作臺(tái)用無(wú)菌水稀釋105倍后涂SD-Ura固體培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d后，對(duì)生長(zhǎng)出的單克隆子計(jì)數(shù)，其結(jié)果如圖2.由圖2知，當(dāng)PFOA濃度為0.6 mmol/L時(shí)，野生型酵母、4基因缺失型酵母突變體和5基因缺失型酵母突變體存活率分別為77.4%、69.7%和50.5%；當(dāng)PFOA 濃度為1.2 mmol/L時(shí)，野生型酵母、4基因缺失型酵母突變體和5基因缺失型酵母突變體存活率分別為35.4%、15.2%、8.0%，4基因缺失型酵母突變體和5基因缺失型酵母突變體的存活率下降比較快；而當(dāng)PFOA濃度大于1.2 mmol/L時(shí)，野生型、4基因缺失型酵母突變體和5基因缺失型酵母突變體存活率都為零(圖中未顯示).與野生型酵母相比，PFOA對(duì)4基因缺失型酵母突變體和5基因缺失型酵母突變體生長(zhǎng)影響比較明顯，而對(duì)5基因缺失型酵母突變體生長(zhǎng)影響尤其明顯.

圖2 PFOA對(duì)酵母毒性實(shí)驗(yàn)(n=4)Fig.2 Effect of the concentration of PFOA on the growth of yeast

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，PFOA對(duì)4基因缺失型酵母突變體和5基因缺失型酵母突變體的影響比野生型酵母細(xì)胞靈敏，可能因?yàn)?基因缺失型酵母突變體和5基因缺失型酵母突變體都缺失了編碼細(xì)胞壁苷露糖和細(xì)胞外排泵蛋白的基因，從而對(duì)外界毒物抗性的抵御機(jī)制減少很多，能很靈敏的感受到外界環(huán)境的壓力；而5基因缺失型酵母突變體比4基因缺失型酵母突變體又少了能調(diào)控許多關(guān)鍵抗氧化基因的表達(dá)的YAP1基因[12]，缺失了YAP1基因的5基因缺失型酵母突變體比4基因缺失型突變體對(duì)PFOA的靈敏性更強(qiáng)，說(shuō)明5基因缺失型酵母突變體受到外界環(huán)境壓力的時(shí)候不能有效的防御細(xì)胞的氧化損傷.

綜上，當(dāng)缺失了編碼細(xì)胞壁苷露糖和細(xì)胞外排泵蛋白的基因的酵母受到外界環(huán)境的壓力或者毒物的脅迫時(shí)，毒物可能以分子的形式從細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞[15]，損害細(xì)胞的正常生理功能，進(jìn)而致使酵母產(chǎn)生氧化損傷[13].

參考文獻(xiàn)：

[1] 范英武, 郎朗, 季宇彬. 全氟辛酸毒性的研究現(xiàn)狀[J]. 食品與藥品, 2008, 10(7): 66-69.

[2] 賀志麗, 賀志霞, 陳瑞琴. 改性活性炭對(duì)水溶液中氟離子的吸附性能[J]. 武漢工程大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 34(1): 43-47.

[3] 韓建, 方展強(qiáng) .水環(huán)境PFOS和PFOA的污染現(xiàn)狀及毒理效應(yīng)進(jìn)展[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志, 2010, 3(2): 99-105.

[4] 劉健, 王海雁, 趙淑江. 全氟辛烷磺?；衔?PFOS)類(lèi)物質(zhì)水環(huán)境污染研究進(jìn)展[J]. 海洋環(huán)境科學(xué), 2011, 30(3): 451-456.

[5] Han X, Ermper K A, Jepson G W. Subcellular distribution and protein binding of perfluorooctanoic acid in rat liver and kidney [J]. Drug Chem Toxicol, 2005, 28(2): 197-209.

[6] 范軼歐, 金一和, 麻懿馨，等. 全氟辛烷磺酸對(duì)雄性大鼠生精功能的影響[J]. 衛(wèi)生研究, 2005, 34 (1): 37-39 .

[7] 胡存麗, 仲來(lái)福. 全氟辛烷磺酸和全氟辛酸毒理學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 19(6): 354-358.

[8] 姚曉峰, 仲來(lái)福. 全氟辛酸對(duì)HepG2細(xì)胞的遺傳毒性及氧化性DNA損傷[J]. 毒性學(xué)雜志, 2005, 19(3): 216-217.

[9] Lau C, Thibodeaux J R,Hanson R G, et al. Exposure to perfluorooctane sulfonate during pregnancy in rat and mouse.Ⅱ.Postnatal evaluation [J].Toxicological Sciences, 2003, 74: 382-392.

[10] Fenton S E,Reiner J L,Nakayama S E, et a1. Analysis of PFOA in dosed CD-1 mice．Part 2.Disposition of PFOA in tissues and fluids from pregnant and lactating mice and their pups[J]. Report Toxicol, 2009, 27(3-4): 365-372.

[11] Shix, Du Y, Lam P. Developmental toxicity and alte-ration of gene expression in zebra fish embryos exposed to PFOS[J]. Toxicological Sciences, 2008, 230(1): 23-32.

[12] Nguyen D T, Alarco A M ， Raymond M. Multiple Yap 1 binding sites mediate induction of the yeast major facilitator FLR1 gene in response to drugs, oxidants and alkylating agents [J]. J Biol Chem. 2009, 276: 1138-1145.

[13] Min Zhang, Chao Zhang, Jia Li. Inactivation of YAP1 Enhances Sensitivity of the Yeast RNR3-lacZ Genotoxicity Testing System to a Broad Range of DNA-Damaging Agents[J]. Toxicological Sciences, 2011, 120(2): 310-321.

[14] Jork J A B, Butenhoff J L, Wallace K B. Multiplicity of nuclear receptor activation by PFOA and PFOS in primary human and rodent hepatocytess[J]. Toxico-logy, 2011,288:8-17.

[15] 汪琨, 徐崢, 汪倩雯，等. 肉桂醛特異性抑制酵母細(xì)胞壁合成的作用機(jī)理[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2012, 38(3): 68-72.

[16] 孫學(xué)志,金軍, 王英. 全氟辛烷磺化物及其環(huán)境問(wèn)題[J]. 環(huán)境污染與防治, 2007, 3(29): 216-220.

[17] Yamada H, Taylor P H, Buck R C, et al. Thermal degradation of fluorotelomer treated articles and related materials[J]. Chemosphere, 2005,61(7):974-984.

[18] Nobuyoshi Y, Kurunthachalan K, Sachi T, et al. A global survey of perfluorinated acids in oceans[J]. Environ Sci Tec hnol, 2005, 50: 658-668.

[19] Kannan K, Corsolini S, Falandysz J, et al. Perfluor-ooctane sulfonate and Related Fluorinated Hydroca-rbons in Marine Mammals, Fishes and Birds from Coasts of the Baltic and the Mediterranean Seas[J]. Environ Sci Technol, 2002, 36(3): 210-216.

[20] Ehresman D J, Froehlich J W, Olsen G W, et al. Comparison of human whole blood, plasma and serum matrices for the determination of perfluorooctane sulfonate (PFOS), perfluorooctanoate (PFOA)[J]. Environ Res, 2007, 103(2): 176-184.

[21] Moriwaki H, Takatah Y, Arakawa R. Concentrations of perfluorooctane sulfonate (PFOS) and perfluoroo-ctanoic acid (PFOA) in vacuum cleaner dust collected in Japanese homes[J]. Environ Monit, 2003, 5: 753-757.