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    殼寡糖種衣劑的制備及其對玉米防御酶系的影響

    2012-06-08 07:54:24趙新華李春紅曹敏建
    湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012年19期
    關(guān)鍵詞:黑穗病衣劑寡糖

    馬 鏑,金 星,趙新華,李春紅,曹敏建

    (沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué),遼寧 沈陽 110866)

    玉米絲黑穗病是絲軸黑粉菌引起的世界性重要病害,在中國北方春玉米產(chǎn)區(qū)發(fā)生較為嚴(yán)重[1]。殼寡糖是植物識別病源真菌入侵的非特異性信號,對許多植物顯示強(qiáng)烈的誘導(dǎo)活性可激發(fā)植物的自身抗性[2]。當(dāng)玉米受到微生物侵染時,會啟動自我防御響應(yīng)以抵抗病原菌進(jìn)攻,這種自我防御能力可以由外源性寡糖誘導(dǎo)產(chǎn)生,激活玉米防御酶系活性,提高自身抵抗力。

    早期對玉米絲黑穗病的研究主要集中在生物學(xué)特性、發(fā)生條件、防治方法等方面[3]。近期出現(xiàn)了對玉米絲黑穗病抗性機(jī)制的研究,如對根系滲出物、Vc和總糖含量與病菌互作的研究,還有對玉米絲黑穗病菌侵染后的寄主防御酶系活性變化的研究[4],但對于殼寡糖誘導(dǎo)抗性的研究未見報道。試驗(yàn)研究了殼寡糖種衣劑和化學(xué)種衣劑處理的玉米在接種和不接種玉米絲黑穗病菌的狀態(tài)下,其防御酶系活性的變化。以期為生產(chǎn)上減少化學(xué)農(nóng)藥使用量提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試材料 玉米品種為先玉335。

    1.1.2 土 樣 采自長白山土壤,共收集25份樣品,采集后自然晾干后置于4℃冰箱保存。

    1.1.3 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基:殼聚糖10 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母膏2 g/L,用土壤浸出液配制。

    平板分離培養(yǎng)基:殼聚糖5.0 g/L,KH2PO42.2 g/L,Na2HPO4·12H2O 1.0 g/L,(NH4)2SO40.8 g/L,NaNO31.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,CaCl20.01 g/L,KCl 1.5 g/L,蛋白胨 0.5 g/L,酵母膏 0.5 g/L,瓊脂15 g/L,pH值6.0,殼聚糖溶液應(yīng)事先調(diào)至pH值6.0,并與其他成分分開滅菌后混和。

    斜面培養(yǎng)基:蛋白胨20 g/L,酵母膏10 g/L,葡萄糖20 g/L,瓊脂20 g/L,pH值自然。

    種子培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母膏 1 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,KCl 1.5 g/L,KH2PO41.9 g/L,Na2HPO4·12H2O 0.9 g/L,Na2SO41.5 g/L,CaCl20.01 g/L,調(diào)至pH值6.5。

    復(fù)篩搖瓶培養(yǎng)基:平板分離培養(yǎng)基中不加瓊脂,另外加入葡萄糖5 g/L,其他相同。

    1.2 儀器

    日本島津紫外-可見分光光度計(UV-12002);H1TACHI低溫離心機(jī)(CR21G)。

    1.3 土壤產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選

    1.3.1 富集培養(yǎng) 取各個土樣各約9 g,置于加有100 mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中,30℃振蕩(180 r/min)30 min,使樣品充分打散后,放置沉淀,取上清液5 mL,加入到事先滅過菌的富集培養(yǎng)基中,28℃搖瓶富集培養(yǎng)3 d。

    1.3.2 菌株分離 以殼聚糖為唯一碳源,用稀釋平板法分離富集后的樣品。于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~5 d,然后選擇在培養(yǎng)基上形成的透明圈直徑與菌落直徑的比值較大的菌落進(jìn)一步進(jìn)行復(fù)篩。

    1.3.3 菌種純化 將菌株分離后得到的斜面培養(yǎng)基內(nèi)的菌株接入種子培養(yǎng)基中30℃振蕩(120 r/min)培養(yǎng)2 d后,用接種環(huán)取少量菌株樣品接入平板固體培養(yǎng)基,采用平皿劃線分離法對菌株進(jìn)行純化,于30℃培養(yǎng)2~6 d后得到的單菌落接入斜面培養(yǎng)基。

    1.3.4 透明圈法篩選 將菌種純化得到的斜面培養(yǎng)基內(nèi)純化好的菌株用滅菌后的牙簽點(diǎn)接種于平板分離培養(yǎng)基上,于30℃培養(yǎng)2~3 d,將菌落周圍透明圈稍大者挑出,接入斜面培養(yǎng)基。于30℃培養(yǎng)2~3 d,觀察產(chǎn)生的透明圈。

    1.3.5 復(fù)篩搖瓶培養(yǎng)法篩選 將透明圈法篩選得到的斜面培養(yǎng)基內(nèi)菌株接入種子培養(yǎng)基中,30℃振蕩(120 r/min)培養(yǎng)2 d后,取8%接種量接入菌種篩選搖瓶培養(yǎng)基,30℃振蕩(120 r/min)培養(yǎng),不同時間檢測酶活力。

    1.4 殼寡糖的制備

    取30.0mL 1.0%的膠體殼聚糖,加入30.0mL pH值5.0乙酸緩沖液稀釋的30.0 mL巨大芽孢桿菌BS-506發(fā)酵酶液,55℃反應(yīng)2 h后,沸水浴10 min終止反應(yīng),加入0.25mol/L NaOH 10.0mL,使未完全反應(yīng)的殼聚糖沉淀,離心,去除沉淀,上清液經(jīng)冷凍干燥制成粉末,配成2%的殼寡糖溶液。

    1.5 試驗(yàn)設(shè)計

    試驗(yàn)共設(shè)4個處理:處理1為15%立克秀,處理2為30%頂苗新,處理3為2%殼寡糖,處理4為空白對照(CK)。各處理均分為接種和不接種玉米絲黑穗病菌兩種方式,3次重復(fù),總計24個小區(qū)。每個小區(qū)播兩行,每埯2粒,株距0.25 m,行距0.6 m,行長6 m,每小區(qū)面積為7.2 m2,試驗(yàn)區(qū)總面積為172.8m2。

    1.6 種植方法

    將每種藥液按定量慢慢沿?zé)诩尤氪鬅瓋?nèi),并將稱取的50倍藥液重量的種子加入燒杯,用手握住燒杯順時針方向甩轉(zhuǎn),直至藥液與種子充分混合均勻,杯壁內(nèi)側(cè)干凈無藥為止,使藥液均勻地附著在種子表面,拌好的種子晾干。

    2011年5月12日播種,采用壟上埯播,播種時,按0.1%加入絲黑穗病菌粉與菌土充分混勻,開穴后先放種子,然后每埯蓋菌土100 g。

    1.7 粗酶液的提取

    分別取8種處理的玉米品種先玉335第3葉,去葉脈后,各稱取1 g,-20℃冰箱保存,待測。同時,配置0.2mol/L pH值8.8的硼酸緩沖液500mL。取出冰箱中的樣品,放入預(yù)冷的研缽中,加入1.5 mL硼酸緩沖液,冰浴中充分研磨后,轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管,用1.5mL上述緩沖液沖洗,合并倒入預(yù)冷的5mL 離心管中,10 000 r/min,4℃離心 20min,上清液即為酶粗提取液。將酶粗提取液迅速倒出,放入-20℃冰箱中保存待用。

    1.8 玉米防御酶系活性測定

    過氧化物酶(POD)活性測定參照李合生等[5]方法。超氧化物歧化酶(SOD)活性測定參照Giannoplitis和Ries[6]及劉鴻先等[7]的方法。多酚氧化酶(PPO)活性測定參照李靖[8]方法。苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定參照Koukol和Cornn[9]方法。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 產(chǎn)殼聚糖酶菌株篩選結(jié)果

    在富集培養(yǎng)基中,以殼聚糖為唯一碳源,通過對各個土樣的富集培養(yǎng),能利用殼聚糖的微生物大大增加,而不能利用的則大部分被淘汰。采用透明圈法,在以殼聚糖為唯一碳源的平板上篩選分離得到了9株產(chǎn)殼聚糖酶菌株。經(jīng)菌落觀察和鏡檢,大部分為霉菌,少數(shù)是細(xì)菌和酵母菌。在培養(yǎng)過程中,挑選菌落生長良好,透明圈明顯的菌落繼續(xù)培養(yǎng),產(chǎn)生的透明圈不斷增大。

    圖1 SH-0109菌株產(chǎn)生的透明圈

    選擇透明圈直徑和菌落直徑比值(D/d)較大的9個菌落為出發(fā)菌株,進(jìn)一步進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,48 h后測定發(fā)酵液的殼聚糖酶酶活,結(jié)果表明SH-0109為產(chǎn)殼聚糖酶最好的菌株,菌落直徑為4.0mm,透明圈直徑30.0mm,透明圈直徑與菌落直徑的比值為7.5,酶活力為0.55 U/mL。

    2.2 種衣劑對玉米葉片POD活性的影響

    過氧化物酶(POD)在植物機(jī)體防御體系中起重要作用,不僅參與了木質(zhì)素的聚合過程,也是細(xì)胞內(nèi)重要的內(nèi)源活性氧清除劑,結(jié)果表明(圖2),無論在接種區(qū)還是非接種區(qū),殼寡糖種衣劑都能提高POD酶活性。使用殼寡糖,POD酶活在接種區(qū)達(dá)28.02 U/mg,非接種區(qū)達(dá)27.57 U/mg,均比對照的POD酶活高。殼寡糖種衣劑可提高POD的活性。因此,可以通過殼寡糖部分取代化學(xué)農(nóng)藥,提高植物體過氧化物酶的活性。

    圖2 種衣劑對玉米POD活性影響

    2.3 種衣劑對玉米葉片SOD活性的影響

    SOD是一種活性氧清除酶類,是植物細(xì)胞內(nèi)防御酶系統(tǒng)的重要成員之一。使用殼寡糖種衣劑,SOD酶活在接種區(qū)達(dá)156.72 U/mg,非接種區(qū)達(dá)150.19 U/mg,均比對照(處理4)的SOD酶活高。試驗(yàn)結(jié)果表明(圖3),無論在接種區(qū)還是非接種區(qū),均表現(xiàn)為殼寡糖種衣劑對SOD酶活提高幅度更大。因此,可以通過殼寡糖部分取代化學(xué)農(nóng)藥,提高植物體自身的防御酶活。

    圖3 種衣劑對玉米SOD活性影響

    2.4 種衣劑對玉米葉片PPO活性的影響

    PPO是一種抗病反應(yīng)次生代謝酶類,主要參與酚類氧化為醌以及木質(zhì)素前體的聚合作用,與植物抗病密切相關(guān)。結(jié)果表明(圖4),無論在接種區(qū)還是非接種區(qū),均表現(xiàn)為殼寡糖種衣劑對PPO酶活提高幅度更大。使用殼寡糖種衣劑,PPO酶活在接種區(qū)達(dá)456.72 U/mg,非接種區(qū)達(dá)440.19 U/mg,均比對照的PPO酶活高。殼寡糖種衣劑可提高PPO的活性。因此,可以通過殼寡糖部分取代化學(xué)農(nóng)藥,提高植物體自身的防御酶活,減低化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境的污染。

    圖4 種衣劑對玉米PPO活性影響

    2.5 種衣劑對玉米葉片PAL活性的影響

    PAL是植物苯丙烷類次生代謝途徑總路第一步關(guān)鍵酶,是苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶,它催化苯丙氨酸脫氨基后產(chǎn)生肉桂酸并最終轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素,因此它是與細(xì)胞內(nèi)木質(zhì)素生成和沉積有關(guān)的防御酶。使用殼寡糖種衣劑,PAL酶活在接種區(qū)達(dá)308.72 U/mg,非接種區(qū)達(dá)303.19 U/mg,均比對照(處理4)的PAL酶活高。殼寡糖種衣劑可提高PAL的活性。結(jié)果表明(圖5),在接種區(qū)和非接種區(qū)均表現(xiàn)為殼寡糖種衣劑對PAL酶活提高幅度更大。

    圖5 種衣劑對玉米PAL活性影響

    3 結(jié)論與討論

    植物的抗病性一般包括植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累與清除、抗病信號的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)導(dǎo)、防衛(wèi)反應(yīng)的表達(dá)與調(diào)控等。在這一復(fù)雜過程中,一些酶類起著很重要的調(diào)控作用,相關(guān)酶類包括活性氧清除酶類和抗病反應(yīng)次生代謝酶類。宋瑞芳等[10]研究認(rèn)為POD是催化脂肪族、芳香族和酚類化合物氧化及木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶之一。PAL是植物抗性物質(zhì)生成途徑莽草酸途徑中酚類物質(zhì)、植保素、木質(zhì)素等抗菌物質(zhì)合成過程中最關(guān)鍵的酶類。PAL是誘導(dǎo)酶,是植物抗病代謝(莽草酸途徑)的關(guān)鍵酶和定速酶,POD不僅參與木質(zhì)素的聚合反應(yīng),而且是細(xì)胞內(nèi)重要的內(nèi)源活性氧清除劑,PPO是酚類物質(zhì)氧化的主要酶,酚類物質(zhì)氧化產(chǎn)生醌類或參與木質(zhì)素的合成,以殺死或抑制病原菌的繁殖而起到抗病作用,SOD能消除超氧自由基而對細(xì)胞具有保護(hù)作用。

    殼寡糖種衣劑作為生物農(nóng)藥在玉米上的報道較少,關(guān)于其誘導(dǎo)玉米自身抗性的研究還未見報道。該研究為進(jìn)一步探討其誘導(dǎo)抗性機(jī)制提供了依據(jù)。研究結(jié)果表明,經(jīng)由立克秀或定苗新處理后4種酶活性均較對照稍低,表明化學(xué)農(nóng)藥對玉米的防御酶系活力有一定傷害;而殼寡糖處理玉米種子之后,植株的防御酶系(PAL、POD、PPO、SOD)活性普遍升高,表明殼寡糖能夠誘導(dǎo)植物的信號系統(tǒng),啟動植株體內(nèi)防御酶系的表達(dá)。殼寡糖通過調(diào)整植物抗病基因的活化,使玉米產(chǎn)生對玉米絲黑穗病的抗性,并非直接作用于病原菌的抑菌反應(yīng)。因此,在病原菌侵入前進(jìn)行殼寡糖種子處理,才能達(dá)到防病的效果。

    [1] 張小飛,高增貴,莊敬華,等.玉米絲黑穗病菌致病性分化研究[J].玉米科學(xué),2010,18(2):100-103.

    [2] 趙龍杰,徐翠蓮,韓富根,等.殼寡糖席夫堿對煙草花葉病毒的誘導(dǎo)抗性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(5):131-133.

    [3] 時俊光,王作英,陳曉旭.幾種玉米種衣劑對玉米絲黑穗防治效果篩選試驗(yàn)研究[J].雜糧作物,2010,30(2):136-137.

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    [5] 李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京:高等教育出版社,2000.164-165.

    [6] Giannoplitis C N,Ries S K.Superoxide dismutase:I.Occurrence in higher plants[J].Plant Physiol,1997,59:309-314.

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